[发明专利]食源性致病菌的检测方法

摘要

食源性致病菌的检测方法，涉及一种细菌的分子鉴定，尤其是涉及一种利用探针编码检测食源性致病菌的方法，它是通过单一反应对多个食源性致病菌进行鉴定的实时PCR方法。提供一种在四色实时PCR仪上可实现对15种模板的基因分型的食源性致病菌的检测方法。将培养后的菌株标本提取DNA；通用引物的设计及PCR产物的测序；设计荧光双链置换探针；设计多色探针编码体系；变温杂交反应；构建单重实时PCR体系；构建多重多色实时PCR体系；验证多重多色实时PCR体系。

主权项

1.食源性致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1)DNA提取：将培养后的菌株标本提取DNA； 2)通用引物的设计及PCR产物的测序：根据食源性致病菌的16SrRNA和23SrRNA基 因的保守区域设计3对通用引物，各引物结合位置如下所示： B.cereus(蜡样芽孢杆菌)，L.monocytogenes(单增李斯特菌)，Proteusspp.(变形杆菌)，V. cholerae(霍乱弧菌)，Streptococcuspyogenes(化脓性链球菌)，S.aureus(金黄色葡萄球菌)的上 游引物(B1-F)序列位于16SRNA的320-339处，序列为5`-CACACTGG(A/G)ACTGAGACA CG-3`，下游引物(B1-R)位于16SRNA的515-532处，序列为5`-CTGCTGGCACG(G/T)AGT TAG-3`； pathogenicE.coli(致病性大肠杆菌)及Shigellaspp.(志贺菌)上游引物(B3-F)位置位于 16SRNA的850-868处，序列为5`-TCATCTCCGGGGGTAGAGC-3`，下游引物(B3-R)位于16S RNA的1031-1049处，序列为5`-TGGGCCTTCCCACATCGTT-3`； V.parahaemolyticus(副溶血弧菌)上游引物(B2-F)位于置位于16SRNA的950-972处， 序列为5`GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG-3`，下游引物(B2-R)位于16SRNA的1089-1110 处，序列为5`-CGGGACTTAACCCAACAT(T/C)TCA-3`.其中B1-F/R、B2-F/R和B3-F/R扩增 片段长度分别为213bp、161bp和200bp； 为了确保探针结合区序列的保守性，对各类代表性菌株的PCR产物进行测序，通过DNA 测序获得相关序列； 3)荧光双链置换探针的设计：将通过DNA测序获得的相关序列结合GenBank中相关的 序列，利用引物设计软件ClustalX(1.8)和Blastn确定3对通用引物扩增区内各目标菌的标 签序列，即探针的特异序列，探针的特异序列如表1： 表1 然后根据探针的特异序列设计荧光双链置换探针，荧光双链置换探针序列如表2： 表2 4)多色探针编码体系设计：采用单色或双色编码的探针检测相应的目标菌，通过荧光标 记的荧光信号组合，实现在单管中对9类常见食源性致病菌的区分和检测，荧光标记和具体 的编码设计方案如表3； 表3 其中蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、致病性大肠杆菌和志贺菌(pathogenicE.coli&Shigella spp.)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)及沙门菌(Salmonellaspp.)采用单色编码的探针 进行检测，这几种菌株标记的特异荧光信号依次分别为FAM、HEX、ROX和CY5副溶血 弧菌(V.parahaemolyticus)、变形杆菌(Proteusspp.)、霍乱弧菌(V.cholerae)、化脓性链球 菌(S.pyogenes)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)则采用双色编码的探针进行检测，这几种菌 株标记的特异荧光信号依次分别为FAM+HEX、FAM+ROX、FAM+CY5、HEX+ROX和 ROX+CY5，根据实时PCR反应中采集的荧光信号的组合类型或编码，即可直接判断所检测 模板的种类； 5)变温杂交反应：为了模拟实时PCR反应中的探针杂交过程，考察探针置换杂交的特 异性，同时确定实时PCR反应的最佳检测温度，合成与检测探针匹配的靶序列及部分干扰序 列见表4；合成的杂交序列比荧光链在两端多出若干个碱基； 表4 表中，^a“^*-w”表示该序列与特异的探针序列完全互补，而代号为“^*-m(1/2/3)”的，为互补 序列的干扰序列..黑体带下划线的碱基为干扰序列中与互补序列不同的碱基； 6)单重实时PCR体系的构建； 7)多重多色实时PCR体系的构建：通过组合单重实时PCR体系，构建多重多色实时PCR 体系，多重多色实时PCR体系含3对通用引物和14对荧光双链置换探针，能在一个PCR管 中对9类食源性致病菌中任意一类的区分和检测； 8)多重多色实时PCR体系的验证：验证采用129个菌株样本，129个菌株样本包括9 种标准菌株和从临床病人或食物中获得的样本，以验证所建立体系的特异性，所述9种标准 菌株为B.cereus(蜡样芽孢杆菌)，L.monocytogenes(单增李斯特菌)，Proteusspp.(变形杆菌)，V. cholerae(霍乱弧菌)，Streptococcuspyogenes(化脓性链球菌)，S.aureus(金黄色葡萄球菌)， pathogenicE.coli(致病性大肠杆菌)，Shigellaspp.(志贺菌)和V.parahaemolyticus(副溶血弧 菌)。