[发明专利]食源性致病菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌的分子鉴定，尤其是涉及一种利用探针编码检测食源性致病菌的方法，它是通过单一反应对多个食源性致病菌进行鉴定的实时PCR方法。

背景技术

传统的细菌鉴定主要依靠细菌培养、血清学、生物化学及细菌形态学等方法进行分类鉴定([6]、Gracias KS and McKillip JL.A review of conventional detection and enumeration methodsfor pathogenic bacteria in food[J].Can J Microbiol，2004，50(11)：883-890)。传统的方法虽然可靠，但是往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果；而且细菌的表型会受环境的影响，从而给鉴定带来困难；此外，当细菌处于“VBNC”状态时，传统方法就难以检测([7]、Oliver JD.The viable but nonculturable state in bacteria[J].J Microbiol，2005，43 Spec No：93-100)。分子生物学手段，尤其是PCR技术以其快速、灵敏、特异等优点在食源性致病菌中广泛应用([1]、Malorny B，Tassios PT，Radstrom P，et al.Standardization of diagnostic PCR for the detection offoodborne pathogens[J].Int J Food Microbiol，2003，83(1)：39-48；[8]、de Boer E and Beumer RR.Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms[J].Int J Food Microbiol，1999，50(1-2)：119-130；[9]、Fung DYC.Rapid methods and automation in microbiology[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2002，1：3-22)，成为传统检测方法重要的补充手段。

在各种PCR手段中，实时PCR将扩增和检测合二为一，具有快速、特异、灵敏和可定量等优点，在病原微生物检测领域有广泛的应用([10]、扈庆华，郑薇薇，石晓路，等.双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(12)：1004-1007；[11]、Nogva HK，Rudi K，Naterstad K，et al.Application of 5′-nuclease PCR forquantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures，water，skim milk，andunpasteurized whole milk[J].Appl Environ Microbiol，2000，66(10)：4266-4271；[12]、Chen W，Martinez G and Mulchandani A.Molecular beacons：a real-time polymerase chain reaction assayfor detecting Salmonella[J].Anal Biochem，2000，280(1)：166-172；[13]、Fukushima H，TsunomoriY and Seki R.Duplex real-time SYBR green PCR assays for detection of 17 species of food-orwaterborne pathogens in stools[J].J Clin Microbiol，2003，41(11)：5134-5146；[14]PalomaresC，Torres MJ，Torres A，et al.Rapid detection and identification of Staphylococcus aureus from bloodculture specimens using real-time fluorescence PCR[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2003，45(3)：183-189)。但多数检测方法使用单个荧光探针，只能检测一种靶序列。开发多目标多任务的实时PCR能进一步提高检测通量和效率，在这方面不断有研究者提出新的方法。利用不同荧光标记的探针，可同时对多个靶序列进行检测，如Vet等人([15]Vet JA，Majithia AR，Marras SA，et al.Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons[J].Proc Natl Acad Sci，1999，96(11)：6394-6399)利用四色实时PCR对HTLV1、HTLV2、HIV-1和HIV-2四种致病性逆转录病毒进行同时检测。但由于受到可检测的荧光种类的限制，实时PCR难以在一次反应中同时检测更多的靶序列。新上市的五色实时PCR仪能同时检测5种不同荧光染料，若使用5种不同的荧光标记探针则至多只能检测5种靶序列。Lee等([16]Lee LG，Livak KJ，Mullah B，et al.Seven-color，homogeneous detection of six PCR products[J].Biotechniques，1999，27(2)：342-349.)利用荧光光度计同步扫描7种荧光染料，也只能同时检测6种靶序列。此外，利用PCR扩增产物的熔点差异，在实时PCR扩增结束后进行熔点曲线分析，可实现多个靶序列的同时检测([17]Elenitoba-Johnson KS，Bohling SD，Wittwer CT，etal.Multiplex PCR by multicolor fluorimetry and fluorescence melting curve analysis[J].Nat Med，2001，7(2)：249-253；[18]Herrmann MG，Dobrowolski SF and Wittwer CT.Rapid beta-globingenotyping by multiplexing probe melting temperature and color[J].Clin Chem，2000，46(3)：425-428)。但由于PCR产物的熔点范围狭窄，熔点曲线分析方法很难容下5个以上产物的同时分析，而且容易受到引物二聚体等非特异扩增的干扰，使结果难以判断。