[发明专利]一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法

摘要

本发明提出了一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法，它主要包括：载体的改造、含有干扰靶序列的DNA序列的产生和将上述含有干扰靶序列的DNA序列克隆到载体三个部分，本发明步骤繁琐，克隆效率低，适合高通量的操作。该方法不需要订购长度大于60nt的引物，不需要对PCR产物进行复杂的酶切纯化处理，而是依赖载体和外源片段连接重组，从而产生完整的lacO序列(乳糖操纵基因)，在lac⁺的大肠杆菌菌株中凭借蓝白斑筛选判断重组子。其筛选方法方便、直观、快捷、高效，得到的重组子不需进行方向鉴定，很容易实现自动化和高通量操作。

主权项

1、一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法，它主要包括：载体的改造、含有干扰靶序列的DNA序列的产生和将上述含有干扰靶序列的DNA序列克隆到载体三个部分，其特征在于具体步骤为：一、载体的改造首先选定一目标载体，将该载体上已经存在的Bfu I或者Bfi I位点以及lacO序列进行诱变，诱变后的载体不再含有Bfu I或者Bfi I位点以及lacO序列，然后在载体的多克隆位点处引入两端带有Bfu I或者Bfi I位点以及一端带有部分lacO序列的填充片段；二、含有干扰靶序列的DNA序列的形成根据RNA干扰载体种类的不同，采取不同的方法完成该步骤：1)针对siRNA载体、shRNA载体，首先设计一对包含靶序列的引物，该引物3’末端含有长度为9-20nt彼此同源的序列，其中一条引物5’端额外加上能够与载体上的部分lacO序列正好重构成完整的lacO序列的lacO部分序列，利用具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶使两条引物退火延伸，得到的产物即为所要的序列；2)针对人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)载体，首先以出发微RNA(microRNA，miRNA)的3’端侧翼序列为模板，该引物的5’端额外加上能够与载体上的部分lacO序列正好重构成完整的lacO序列的lacO部分序列，然后根据出发miRNA环序列长短不同，又分为以下两种情况：a)当环序列小于30nt时，设计一对包含靶序列的引物，其3’末端分别带有部分环序列，且使该引物3’末端序列彼此部分同源，序列长度为9-20nt，其中与出发miRNA 3’端退火的那条引物5’端与上面设计的通用引物含15-20nt同源序列，利用具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶使该对引物以及通用引物三者相互退火延伸，得到的产物即为所要的序列；b)当环序列大于30nt时，设计一对包含靶序列的引物，其3’末端分别带有可以和出发miRNA的环序列退火的部分序列，其中与出发miRNA 3’端退火的那条引物的5’端与上面设计的通用引物含15—20nt同源序列，以含有相应环序列的DNA序列为模板，用上述设计的一对特异引物、一条通用引物和具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶进行PCR，得到的产物即为所要的序列；三、载体与外源片段的连接转化首先将步骤一中改造好的载体经Bfu I或者Bfi I完全酶切，得到3’端突出一个碱基的线性载体DNA分子，所得的线性载体经回收纯化，然后与纯化过的步骤二中获得的含有靶序列的PCR产物进行连接，转化大肠杆菌菌株DH10β，涂布含100μg/ml氨苄青霉素或其它抗生素以及30μg/mlX-gal的LB固体培养基，37℃培养12-16小时，呈现蓝色的菌落即为重组子；四、含有靶序列的RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上对于能够直接用于步骤一改造的RNAi载体，则能够省略该步骤，对于不能直接改造的植物双元表达载体，应先选择一个比较小的克隆载体按步骤一进行改造，然后通过酶切连接、Gateway重组克隆以及接合转移方法将RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上。