[发明专利]一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速、高效、高通量构建动植物RNA干扰(RNA interference，RNAi)载体的方法。特别适合用于大规模地构建针对动植物各个基因的RNA干扰单元，用于动植物基因的功能研究，而且筛选方便快捷。

背景技术

RNA干扰是指在正常生物体内，由双链RNA引起同源mRNA的特异性降解，从而抑制相应基因表达的过程。它是一种转录后水平基因沉默，在生物体内普遍存在。随着研究者对生命现象研究的深入，RNA干扰技术因其高特异性、高效率、操作简便、重复性好，已经成为当今动植物基因功能、基因治疗、药物靶点筛选与鉴定、植物代谢以及细胞信号传导通路等研究中的重要手段之一。

归纳起来，现行的RNA干扰载体构建方法主要有以下三种：①寡核苷酸退火法。由化学合成的部分互补、含有干扰目的基因的靶序列的两条寡核苷酸单链，在离体条件下退火形成双链DNA，退火产生两端突出的粘性末端，能与处理好的载体的突出末端互补，经连接转化后，得到含有RNA干扰表达单元的重组质粒。化学合成的寡核苷酸通常为反向重复序列，这样转录得到的单链RNA能够回折互补配对，形成茎环结构，在细胞内经处理后形成小干扰RNA(siRNA)而引发RNA干扰效应。②PCR扩增法。构建动物细胞RNA干扰载体时，先设计一对扩增控制RNA干扰单元表达的启动子的PCR引物，正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到表达RNA干扰单元的载体。构建植物人工微RNA(miRNA)表达载体时，先按照需要设计三对引物，进行三轮独立的PCR，获得的三种PCR产物分别含有：待干扰的目的基因的靶序列、miRNA的环序列以及待干扰的目的基因靶序列的互补序列；然后采用重叠延伸PCR的方法将获得的三种PCR产物拼接成完整的人工miRNA茎环结构序列，再将其克隆到植物双元载体上。采用PCR方法构建植物人工miRNA载体的另一种方式是先设计并合成一对引物，引物5′端为额外添加的酶切位点与目的基因的干扰靶序列或其互补序列，3′端为与骨架miRNA中的环序列退火区域，获得的PCR产物经酶切回收后克隆到载体上。③寡核苷酸退火延伸法。化学合成两条部分互补的寡核苷酸单链，在非互补的单链区域分别含有干扰目的基因的靶序列及其互补序列，在特定条件下使两条单链退火，然后延伸形成完整的小双链DNA分子，经酶切处理后克隆到载体上。

以上方法虽然能够成功构建各种RNA干扰载体，但是明显存在不足，主要表现在以下几个方面：

一、步骤繁琐，克隆效率低。以上三种方法都需要对克隆的目的片段和载体进行特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。方法①需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此难以纯化，得率低，而且获得正确的重组质粒较困难，假阳性率高。方法②需要在PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列，通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反应，扩增后的PCR产物也需要酶切纯化，然后与处理好的载体进行连接反应；方法③中两条寡核苷酸单链退火延伸得到的产物必须经过复杂的回收纯化、酶切纯化等步骤后，才能克隆到相应载体。方法②③不仅花费时间，工序繁琐，而且载体连接上非目的片段或自连的几率很高，使后续的筛选鉴定过程复杂化。

二、不适合高通量的操作。

以上三种方法中的待克隆片段都需要预先纯化处理，都依赖于载体与外源片段的连接反应，这对于构建单个或少数RNA干扰载体可能可行，但是对于大规模地构建RNA干扰载体来讲却非常困难，而且效率低下。方法①和②中使用的寡核苷酸单链通常为60-100nt，合成这样的寡核苷酸单链不仅实验成本高，而且碱基合成错误率高，进而大大增加了后续的筛选工作量，费时费力。方法②和③中的外源片段都需要经过复杂的双酶切、回收纯化等步骤，因外源片段一般都较小(200bp以内)，回收纯化效率较低，这两种方法不仅实验成本昂贵，而且后续筛选困难，工作量大。

(参见刊物“RNA.2002 8：1454-1460”；“Plant Cell.2006 May；18(5)：1121-33.”；“Nat Biotechnol.2006 Nov；24(11)：1420-8.”；″Physiol Genomics.2007 Nov14；31(3)：554-62.″参见网页www.invitrogen.com或Invitrogen公司产品目录)

发明内容