[发明专利]一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法

摘要

本发明公开了一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，包括(1)菌种选择(2)斜面培养(3)摇瓶发酵培养(4)发酵罐扩大培养(5)收集发酵产物(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化等步骤；本发明方法可以快速大量获得高纯度的青霉源性抗菌肽，并且方法简便、成本低、周期短、技术上容易实现，适于工业化生产，分离纯化后的青霉源性抗菌肽最终纯度大于97％以上，可明显抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗药株，MIC为500μg/ml，极具应用前景。

主权项

1.一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，25～30℃条件下，静止培养2～5d；(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为1～8％的接种量，将孢子悬浮液加入装有100～200mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，25～30℃条件下，振荡培养4～5d，制得种子液；(4)发酵罐扩大培养：无菌条件下以体积比为1～10％的接种量，将种子液接种于装有4～6L发酵培养基的7～10L发酵罐中，然后按照2～3滴/L的量加入消泡剂，密闭，以搅拌速度300～350rpm，25～30℃条件，振荡培养68～100小时；(5)收集发酵产物：将步骤(4)所得的发酵液用两层纱布过滤除去菌丝，滤液于12000rpm离心30～40min，收集上清液；上清液经截留分子量5000的滤膜超滤1次，滤过液以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得到的黄褐色粉末即为青霉源性抗菌肽的粗品；(6)青霉源性抗菌肽的分离纯化：将步骤(5)中获得的青霉源性抗菌肽的粗品用蒸馏水溶解使浓度为1g/3ml，通过Sephadex LH-20分子筛柱层析进行初步分离；上样量3ml，双蒸水洗脱，流速5ml/20min，220nm检测，每20min收集一管，留取洗脱体积150ml～200ml时的洗脱液，以温度为-50℃±1℃，真空压力为0.13mbar±0.01mbar的条件进行低温减压干燥，得黄色粉末；将制得的黄色粉末进行第一次HPLC分离，柱型：SCR-101C Ca型糖柱，7.9mm×30cm；上样量30μl；流速0.5ml/min；折光示差检测器；流动相：Milipure水；收集第4个洗脱峰，洗脱液以前述条件进行低温减压干燥，得淡黄色粉末；将制得的淡黄色粉末进行第二次HPLC分离，分离条件同第一次，洗脱峰只有一个单峰，收集洗脱液并以前述条件进行低温减压干燥，得白色粉末即为青霉源性抗菌肽纯品；其中：上述种子培养基配方为：麸皮100g，水1L，煮沸30min；过滤，添加琼脂15～20g；上述发酵培养基配方为：每1000毫升蒸馏水中添加麦芽糖15g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，(NH4)2SO4 18g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g；pH 7.0。