[发明专利]一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗菌活性的青霉源性抗菌肽的制备方法，尤其涉及一种利用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)制备青霉源性抗菌肽的方法。属生物制药领域。

背景技术

抗生素的抗药性问题日益严重，目前常见病原菌(如金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎链球菌)等的抗药株不断增加，且在不同抗生素间普遍有交叉抗药性；致使医院在治疗病原菌引起的临床感染时可选用的抗生素十分有限。由于临床用药的迫切需要，近年来人们已越来越重视寻找抗抗药性金葡菌、肠球菌和肺炎链球菌的抗生素。

抗菌肽以其广谱、高效、不易产生抗性菌等特点在临床上日益受到重视。抗菌肽对生物有天然免疫作用，具有广谱的抗菌性能，对革兰氏阴性和阳性细菌均具有杀灭或抑制作用，对真菌、病毒、癌细胞也有作用，被称为“第二防御体系”。抗菌肽作用于细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，使小分子代谢物快速流出细胞外，使细菌不能保持正常渗透压而死亡，细菌难以对其产生抗药性。随着对抗菌肽了解的增多和新型抗菌肽的发现，抗菌肽已经成为人类对抗病原细菌和真菌感染的新兴药物的重要成员。一些生物技术公司已经建立了抗菌肽在疾病治疗中的应用平台。Datamonitor公司的研究报告显示：蛋白质类药物市场在今后10年内将快速增长，并更具吸引力，其中，多肽药物是不容忽视的亮点。2002年，美国、英国、德国、法国、意大利、西班牙和日本这世界七大药物市场上的抗菌药物总值高达150亿美元，肽类药物占有绝对份额。2002年世界七大药物市场中用于治疗革兰氏阳性抗药菌株引致感染的抗生素销售额约为3亿美元，而肽类药物占了这一细分市场近80％的份额。美国占有全球肽类药物市场的65％，欧洲占30％，其中主要市场在德国和英国；亚洲的主要市场在日本。

虽然抗菌肽在医药工业中有广阔的应用前景，但要成为能实际应用于临床的抗感染类药物，还存在一些亟待解决的问题：(1)现有抗菌肽多采用化学方法合成，成本偏高；(2)若采用基因工程方法合成，目前又尚未形成一种适用于工业化生产的方法；(3)外源性的抗菌肽会被体内蛋白酶降解，尚未有成熟的方法解决这一问题。

实验证实，微生物来源的抗菌肽不存在上述问题。目前，有近2 000万株微生物药物产生菌被分离出来，被描述的微生物药物有20 000种，每年有200多种微生物来源的新化合物被报道，但迄今为止，已明确结构的真菌源抗菌肽不足500种，实际应用于临床的更少。因此，从微生物中寻找开发具有自主知识产权的抗抗药菌的肽类抗生素具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提出一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法，以实现从灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)发酵液中提取并获得能抑制抗性病原菌的肽类抗菌物质的目的。

本发明所述的灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)已于2008年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No.2325。

上述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)基本特征是：菌落在查氏琼脂(CA)平板上生长适度，25℃ 7天直径26-28mm；有辐射状波纹；质地绒状；边缘白色，中部暗黄绿色，反面黄白色。分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎180-350x2.5-3.5μm，壁平滑；帚状枝双轮生，少见生有副枝者，双轮生者每轮梗基2-4个，排列紧密，10-14x2.5-3.2μm；瓶梗安瓿瓶，每轮4-8个，8.5-11.5x2.0-2.5μm；分生孢子球形、近球形，2.5-3.5μm，平滑，分生孢子链长。

利用本发明所述灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)制备青霉源性抗菌肽的方法，具体步骤如下：

(1)菌种选择：选用灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)CGMCC No.2325；

(2)斜面培养：将上述菌种接种于种子培养基中，25～30℃条件下，静止培养2～5d；

(3)摇瓶发酵培养：用灭菌蒸馏水冲洗步骤(2)培养后的菌株，收集洗下的孢子并用玻璃珠充分摇散，制成孢子悬浮液；在无菌条件下以体积比为1～8％的接种量，将孢子悬浮液加入装有100～200mL发酵培养基的500ml三角瓶中，置120rpm摇床，25～30℃条件下，振荡培养4～5d，制得种子液；