[发明专利]赤星病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药性的分子检测方法

摘要

本发明涉及一种赤星病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药性的分子检测方法，属于分子生物学和植物病理学领域。本发明设计了9条DNA Walking引物用于扩增双组分组氨酸蛋白激酶基因，另外设计了2对特异引物用于快速扩增双组分组氨酸蛋白激酶全基因和双组分组氨酸蛋白激酶基因N端六个90氨基酸重复区。本发明以烟草赤星病菌(Alternaria.alternata)基因组DNA作为模板，利用所设计引物快速扩增双组分组氨酸蛋白激酶全基因和双组分组氨酸蛋白激酶基因N端六个90氨基酸重复区，通过基因序列比对确定烟草赤星病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂是否产生抗药性。本发明具有快捷、简便、经济等优点，在烟草赤星病抗性监测上具有良好的应用前景。

主权项

1、一种赤星病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂抗药性的分子检测方法，包括真菌的分离与培养、真菌基因组DNA的提取、用引物进行PCR扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用引物由下列方法设计得到：(1)选择在GenBank上发表的索引号是AF489110的部分长度的双组分组氨酸蛋白激酶基因序列，用DNA Walking SpeedUpTM Premix试剂盒设计如下引物：5′端PCR后引物：TSP1(5′--3′)：CTCAAGTCACCCATAGCGTSP2(5′--3′)：TCACCCATAGCGACGGCAGTTSP3(5′--3′)：CATAGCGACGGCAGTGACGAT；3’端第一次PCR前引物：TSP1(5′--3′)：TAGCATCAAGAGCCGACGAGTSP2(5′--3′)：CCGACGAGCGGAAGTTGAATSP3(5′--3′)：CTTACAAGGTGCCCGACTACG；3’端第二次PCR前引物：TSP1(5′--3′)：GCACGGGAGCTTAGGATTGTSP2(5′--3′)：5’-TCAGGTCTGCGCTAGAAAACGTSP3(5′--3′)：5’-TATGACGACGCCCTGTCTACC；(2)通过三次PCR扩增，5’端一次，3’端两次，将PCR扩增片段纯化出来并和pMD18-T载体连接，然后通过转化，将含有目的片段的克隆子培养液送测序公司测序，根据DNA Walking SpeedUpTM Premix试剂盒得到的片段和部分长度双组分组氨酸蛋白激酶基因片段的拼接结果得到了野生型敏感链格孢菌13-3菌株的双组分组氨酸蛋白激酶基因全长序列SEQ ID NO.1；(3)根据在GenBank上发表的索引号是AF489110的部分长度双组分组氨酸蛋白激酶基因序列以及野生型敏感链格孢菌13-3菌株的双组分组氨酸蛋白激酶基因全长序列SEQID NO.1，利用生物分析软件Primer premier5设计如下引物；扩增双组分组氨酸蛋白激酶基因全长序列SEQ ID NO.1的引物：AaHKFp I(5′--3′)：CTGTCCATCTTGCCCGTTCCAaHKRp II(5′--3′)：CGGCTAAAACAGTTCTTTCGGTA；扩增双组分组氨酸蛋白激酶基因N端六个90氨基酸重复区的引物：HKFwd(5′--3′)：AGGCTGACAGACAACAGACAAHKRev(5′--3′)：CGAGCGTAAGTTGGGTCAT。