本发明提供了一种乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122三重荧光定量PCR检测试剂盒,其包括乙型肝炎病毒miR‑3的逆转录引物如SEQ ID NO.1所示、荧光探针如SEQ ID NO.2所示、PCR引物如SEQ ID NO.3和4所示,还可以进一步包括人肝脏特异性miR‑122的逆转录引物如SEQ ID NO.5所示、荧光探针如SEQ ID NO.6所示、PCR引物如SEQ ID NO.7和8所示,还可以进一步包括内参逆转录引物如SEQ ID NO.9所示、荧光探针如SEQ ID NO.10所示、PCR引物如SEQ ID NO.11和12所示。该试剂盒使用三重荧光定量PCR的方法从微量(100μl)血清或血浆中检测乙型肝炎病毒miR‑3和人肝脏特异性miR‑122的浓度,检测方法特异、高效、灵敏。该试剂盒能够用于乙型肝炎病毒复制情况的监控、抗病毒药物疗效和预后的评估和肝脏损伤的评测,具有重要的临床意义。