本发明公开了一种AscI限制性内切酶的制备方法,包括以下步骤:步骤一、合成AscI.M‑R限制‑修饰系统的编码基因,构建至原核表达载体,获得重组载体,所述AscI.M‑R限制‑修饰系统编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示;步骤二、将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中,获得重组菌;步骤三、AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。本发明通过密码子优化来调整修饰酶与限制酶的表达量,只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达,能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的AscI限制性内切酶,操作流程简化,成本低,成功率高。