本发明公开了一种针对缺失MGF505‑2R基因、EP402R基因或I177L基因等不同基因缺失型的非洲猪瘟病毒的多重qPCR试剂盒及检测方法;所述试剂盒包括如序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.12所述的引物和探针。所述的检测方法是采用上述试剂盒的多重qPCR检测方法,其是将猪组织样品、全血或者环境拭子等样本进行总DNA提取,然后进行qPCR检测分析,确定并区分不同基因缺失型的非洲猪瘟毒株。本发明方法具有特异性好、灵敏度高的优点,能够同时检测野生型以及缺失MGF505‑2R基因、EP402R基因或I177L基因的ASFV毒株,为实验室检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。