本发明公开了一种黄花菜鲜味肽及其制备方法和应用。将黄花菜酶解得到含有鲜味肽的酶解液,经提纯后得到黄花菜鲜味肽;所述酶解方法为,超声辅助法前处理,5000~7000U/L纤维素酶对黄花菜破壁,300~400kU/L中性蛋白酶和80~100kU/L风味蛋白酶在49~55℃,pH5.87~6.50条件下酶解380~420min,能提高黄花菜的鲜味和多肽含量,增加蛋白回收率。所述黄花菜鲜味肽由不同分子量和感官风味的鲜味肽组成,具体地,包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1~25中的一条或几条所示的鲜味肽。