本申请涉及一种核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用,核酸组合物,包括目标微生物的核酸扩增引物,目标微生物包括扣囊复膜酵母、横梗霉和黄曲霉中的至少一种;其中,扣囊复膜酵母的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对;横梗霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对;黄曲霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对。本申请的核酸组合物能够用于对各个制曲阶段的大曲样本中的目标微生物进行定量分析,进而区分整优曲和整次曲,从而实现快速、客观地检测各个制曲阶段的大曲质量。