本发明公开了一种二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体及其制备方法与应用。该二硫键稳定的抗bFGF人源双链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该抗bFGF人源双链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明是在单链抗体的基础上,通过定点突变引入2个半胱氨酸从而引入二硫键,构建成ds-Diabody。通过实验证明,得到的ds-Diabody具有如下优点:稳定性增强;其与抗原bFGF特异性结合,亲和力更好;相对分子质量适中,具有良好的肿瘤靶向、瘤组织穿透力和较长的血液清除率,在临床诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。