本发明属于分子检测技术领域,具体为同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫的双重PCR的引物及方法和应用,包括以下引物:猪内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.suis F和下游引物E.suis R、波氏内阿米巴原虫种特异性引物的上游引物E.poleckiF和下游引物E.polecki R;E.suis F、E.suisR、E.poleckiF、E.polecki R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示,本发明能同时检测猪内阿米巴原虫和波氏内阿米巴原虫,最低能检查到400fg/μL的阳性DNA。