本发明涉及一种大肠杆菌H血清型分型检测试剂盒,其包括扩增大肠杆菌H血清型H1~H12、H14~H21、H23~H49、H51~H56的PCR引物,引物序列见SEQ ID NO.1‑106,还包括H血清型分型标准物。本发明解决了现有技术中对大肠杆菌H血清型分型方法的技术要求高、不全面、耗时、耗力以及交叉反应导致的误判问题,利用本发明的试剂盒对大肠杆菌H血清型进行分型检测,使分型检测更客观、简便和准确,并可同时检测大肠杆菌53个血清型,分型效果与传统血清分型一致,检测过程操作简便,结合毛细管电泳对扩增产物进行分析,可实现大肠杆菌H血清型分型检测的自动化与高通量。