本发明涉及分子生物学技术领域,公开了一种突变型DNA聚合酶及其制备方法与应用,该突变型DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,该氨基酸序列是在野生型FWT聚合酶的基础上突变得到,其突变位点包括:第80位的丙氨酸突变为精氨酸、第107位的天冬酰胺突变为天冬氨酸、第172位的谷氨酸突变为精氨酸、第325位的天冬酰胺突变为天冬氨酸、第423位的天冬氨酸突变为丙氨酸、第490位的丝氨酸突变为丙氨酸、第491位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。该突变型DNA聚合酶在室温条件下具有相比于野生型更好的持续合成、链置换以及耐高盐能力,是滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。