本发明提供了一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合及其应用,所述检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的引物探针组合包括扩增并检测二氢叶酸合成酶基因的引物对和探针;扩增所述二氢叶酸合成酶基因的引物对包括SEQ ID No.1~2所示的核苷酸序列,检测所述二氢叶酸合成酶基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的试剂盒及其以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法以及一种检测耶氏肺孢子菌及其耐药突变的装置。所述引物探针组合特异性好,灵敏度高,所述试剂盒设计合理,使用方便,应用前景广阔。