本发明提供了一种基于核酸质谱技术可以同时检测27种呼吸道病原体的引物组、试剂盒和应用，属于病原体核酸检测领域。本发明试剂盒针对临床常见的27种呼吸道病原体设计了PCR扩增引物和单碱基延伸引物。病原菌对应引物和单碱基延伸引物序列见SEQ ID NO:1‑81。本发明的核酸质谱法整合了多重RT‑PCR技术和单碱基延伸技术，通过多重RT‑PCR对病原体目标基因进行扩增，提高检出的灵敏性；单碱基延伸反应通过对延伸引物进行一个碱基扩增，然后通过区分延伸产物分子质量进行病原体识别，特异性高。同时，核酸质谱的通量高，一个反应孔最高可实现40重基因的扩增，借助于芯片技术，单次最高可对384个样本进行分析；具有自动化程度高、检测通量高、灵敏度高、特异性好的优点。
本发明TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用，包括如下引物和探针：(1)TMA反应引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；(2)分子信标探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示；(3)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明属于微生物学领域，本发明的试剂盒可以实现准确、快捷、高通量对临床常见致病细菌的检测，从而实现临床样本感染菌的快速鉴定，为临床细菌感染患者准备合理地进行抗菌药物治疗提供指导，进而避免抗生素的滥用，为患者节省宝贵的治疗时间。
