[发明专利]转谷氨酰胺酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及新型的转谷氨酰胺酶的制备方法，具体而言，涉及将变性状态的转谷氨酰胺酶重折叠成具有酶活性、与天然状态的酶基本上具有同等活性的转谷氨酰胺酶的制备方法。通过该方法可以将变性的微生物转谷氨酰胺酶重折叠成具有酶活性的天然状态的酶，可以将用基因重组技术生产的无活性酶蛋白质变换成大量且廉价的高活性的酶，能广泛应用于食品加工领域。

背景技术

转谷氨酰胺酶可应用于果冻等胶状食品、酸奶、奶酪、或胶状化妆品等的制备和肉食的改造等，还可广泛应用于除此之外的领域，是工业上极其有用的酶。

转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13；TGase)是催化蛋白质或多肽链的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与一级胺基间的乙酰基转移反应的酶，其中，将从微生物(茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobraense)的变种)培养上清中发现的转谷氨酰胺酶称之为微生物来源的转谷氨酰胺酶(MTG)。

MTG是由331个氨基酸构成的分子量为38000的单聚体蛋白质(生物化学杂志，268，11565-11572，1993)。为了大量生产该酶，就力求使上述微生物的培养条件最适化(Agricaltural BiologicalChemistry，53，2613-，1989)，但该微生物不能广泛应用于以往蛋白质的工业生产，生产量和生产耗费等方面也存在许多问题。另外，该酶虽可在菌体外以活性状态分泌，但由于它分子内具有4处通过脱酰胺反应而容易进行化学修饰的序列，在进行分泌生产的过程中培养液中进行了化学修饰，回收的培养上清中蓄积了活性很低的酶。为了解决这些问题，对应用大肠杆菌等微生物的基因重组MTG的生产法进行了各种探索(Bioscience and Bioindustry，52，554-561，1994)。

若让该酶的序列在大肠杆菌的菌体表达，其表达量甚微，但通过与可高表达的T7基因10来源的序列片段融合可成功地高表达融合蛋白质。但是，将该融合蛋白限制性分解而得到的具有原本序列的酶的活性，是天然状态下转谷氨酰胺酶的1/5，这提示了用该方法得到的酶的高级结构的不完全性(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)。此外，从融合蛋白中仅切出该酶的序列，就有必要通过消化酶或化学手段进行限制性分解，问题是不仅制备方法复杂，而且生产耗费高。

要解决以上问题，就有必要获得用微生物直接高表达该酶序列的技术，获得将回收的变性状态的酶完全再形成高级结构、恢复酶活性的技术(再折叠技术)。先前，本申请人在大肠杆菌菌体内表达MTG时，将使用的密码子变成宿主大肠杆菌用的，通过大幅度增加质粒的拷贝数而成功地实现目前为止尚不可能的在菌体内高表达该酶序列，并将该内容申请了专利(特愿平10-181951号，平成10年6月29日申请，特开平11-075876号(平成11年3月23日公开)，以下将该发明称为“以前的发明”)。

在这种状况下，努力开发优良的重折叠方法。

发明的课题、目的

可是，对于蛋白质的重折叠技术来讲，预测检测目标蛋白质的天然状态的适宜条件是不可能的，有必要用实际的目标蛋白质进行各自操作条件的试验性探索(Advances in Protein Chemistry，50，1-59，1997)。根据以前的发明(上述本申请人申请的专利)，可从大量变性状态的该酶入手，在这里初次探讨该酶重折叠技术。

本发明的目的是为了建立该酶的廉价的工业制备方法，开发由基因重组微生物生产的变性状态下获得的该酶的重折叠方法，提供基本上与天然状态的转谷氨酰胺酶具有同等酶活性(即转谷氨酰胺酶活性)的转谷氨酰胺酶的制备方法。发明的公开

以解决上述课题为本发明的目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现变性状态下的转谷氨酰胺酶至少要经过包含下述工序(a)和(b)的工序才能有效的制备出具有酶活性的转谷氨酰胺酶：(a)将该变性状态的酶形成中间结构的工序，所述的中间结构是形成在水性溶剂中、酸性条件下具有酶活性的结构的中间结构；以及(b)将已经形成上述结构形成的中间结构的酶形成高级结构的工序，所述的高级结构是在水性溶剂中、pH值中性范围内具有酶活性的高级结构。

也就是说，本发明为至少包括上述步骤(a)和(b)，特别是包括重折叠步骤的转谷氨酰胺酶的制备方法。