[发明专利]筛选治疗剂的方法

说明书

本发明涉及核苷酸序列，特别是授予TGFβ和活化素和结合Smad蛋白的转录调控序列，涉及该序列在例如筛选用于治疗与Smad-介导的TGFβ-诱导的基因不正常表达相关的疾病的药剂中的用途。

β转化生长因子(TGFβ)属于细胞因子家族，包括活化素和骨形态发生蛋白，其由很多细胞类型合成并且具有多种细胞和生物作用，包括控制增殖，分化，迁移，免疫性和调节胞外基质的更新。其中很多涉及TGFβ，以TGFβ-1为例，作为转录激活因子而起作用。已知几种启动子由TGFβ诱导，包括1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAl-1)，α2(Ⅰ)前胶原，TGFβ-1本身，种系Ⅰgα恒定区，依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDK)抑制剂p21和p15。

蛋白质Smad家族成员在通过没有完全阐明的机理介导TGFβ和活化素转录活化中起着必不可少的作用。已经证明果蝇属MAD定向进化同源蛋白的氨基末端部分结合对于转录调控是重要的退化基因的增强子(Kim等，自然，1997，388，304-308)。非洲爪蟾属Smad2和Smad4蛋白是称之为活化素-应答因子(ARF)也包含FAST-1转录因子的蛋白质复合体的成分。ARF结合诱导活化素的非洲爪蟾属Mix.2启动子的能力是FAST-1赋与的并且提出Smad2/Smad4作为辅激活物起作用(Chen等，自然，1996，383，691-696；Chen等，自然，1997，389，85-89)。在涉及TGFβ信号的那些Smad蛋白中，已知Smad6和7作为TGFβ信号途径的抑制剂而起作用，已知Smad2和3介导TGFβ信号途径，并且已知Smad4形成包含至少Smad2和3的异型寡聚物(Heldin等，自然，1997，390，465-471)。已经证明Smad4结合制备的构建物的DNA序列，但是这种结合活性不带来依赖TGFβ的转录活性作用(Yingling等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，1997，17，7019-7028)。

现在我们证明了包括两种蛋白质Smad3和Smad4和DNA的复合体的存在，并且证明Smad3，Smad4是DNA结合蛋白。我们还证明在外显子中剪接的Smad2是一种DNA结合蛋白。此外，我们鉴定了TGFβ响应启动子中的Smad3/4-结合序列并且证明Smad3/4的结合对于TGFβ诱导的转录作用是必须的。

已知很多疾病状态与TGFβ控制的基因表达的变异有关，包括纤维变性疾病，异常的伤口愈合，异常的骨生成，癌发生，造血，神经保护和免疫和炎症疾病。研究最多的是PAL-1基因，其是TGFβ激活的基因之一。由几种细胞类型产生PAL-1蛋白质，包括内皮细胞，成纤维细胞，上皮细胞和肝实质细胞。其依靠其对各自催化从纤溶酶原生成纤溶酶的尿激酶(U-PA)和组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的抑制作用间接控制丝氨酸蛋白酶纤溶酶的活性。

纤溶酶直接地通过消化基质成分和间接地通过其激活基质降解酶的潜伏形式而在胞外基质的生成和保持中起着重要的作用。纤溶酶的主要作用是去除血纤蛋白凝块。因此纤溶酶对于维管结构(即血纤蛋白)和基质具有双重特异性。因为纤溶酶的水平是由PAL-1控制的，因此PAL-1在影响纤溶性平衡和控制纤维病变的量中起着重要作用。调节基质沉积的能力对多种指征在治疗上是重要的，所述指征包括伤口愈合，肥大伤疤，瘢痕瘤，scleroclerma，肝和胆囊纤维化，肺纤维化，肾纤维化，血管纤维化和术后粘连(Franklin,Int.J.Biochem.CellBiol.,1997,29,78-89)。当前没有对于纤维变性的治疗方法。

我们发现Smad3，Smad4和在外显子3中剪接的Smad2是DNA结合蛋白，其结合TGFβ激活的启动子，例如PAL-1，这一发现为开发出治疗与通过调节Smad3或Smad4或外显子3中剪接的Smad2(或者事实上任何包含Smad3或Smad4的蛋白质复合体)与其识别序列的结合或转录活性而完成的Smad-介导的TGFβ基因调节相关的疾病的新的方法铺平道路，从而影响筛选能调节TGFβ-调控基因表达，通过影响包含Smad的复合体(即Smad3和Smad4和在外显子3中剪接的Smad2)结合其识别序列的程度，或结合于其基因启动子中的识别序列的Smad的复合体(即Smad3和Smad4和在外显子3中剪接的Smad2)的转录能力而用于治疗的基因药剂的方法。