[发明专利]检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法

说明书

发明领域

本发明涉及检测样品中基因毒性化合物的诊断系统和方法。

发明背景和现有技术

国际专利申请PCT/EP96/01745描述了一种重组的核酸序列，和包含此核酸序列的宿主微生物，以及此宿主微生物用来检测样品中基因毒性化合物的用途。所述细菌基因毒性测验是根据生物发光，而使基因毒性化合物得到简易、迅捷、低成本的检测。此测验表现出与埃姆斯测验法和SOS显色法至少一样灵敏，且可给出基因毒性动力学测定，并同时评价受测化合物或材料的毒性(Van der Lelie等人，1977)。因此，称为VITOTOX^的这种新测验被认为是一种有价值的、短期基因毒性和毒性测验，可用于许多不同目的。

这种测验基于含lux操纵子的细菌，lux操纵子源于弗氏弧菌(Vibriofishcheri)，其转录受到recN基因的调控，是SOS系统的一部分。这种细菌在基因毒性化合物存在的条件下培养后，recN启动子被去阻遏，导致lux操纵子表达。这种表达在基因毒性作用下导致光的产生。起初，此测验是利用经改造的大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的不同菌株而完成的。作为周知的用于诱变性测验的菌株，使用鼠伤寒沙门氏菌菌株(TA98，TA100和TA104)。而且，一旦需要相同菌株也可用于″经典的″埃姆斯测验法。在所有菌株中，利用recN启动子启动区突变构建体(recN 2-4)给出的测验结果最好。此外，由于所有的沙门氏菌菌株给出相近的结果，已建议只进一步使用TA104构建体(称为TA 104(recN2-4))，因其有时比其它杂交菌株表现更灵敏(Vander Lelie等人，1997)。

然而，某些化合物可直接作用于光的产生(如醛类、有机溶剂)，或增强细菌代谢造成假阳性的结果。

发明目的

本发明旨在提供一种新的诊断系统和方法，用于检测环境胁迫(environmentol insult)物质，如样品中的基因毒性化合物的存在，这种方法不存在现有技术的种种缺点。

本发明的主要目的是提供一种新的诊断系统和方法，这种系统和方法去除了假阳性和假阴性的结果。

本发明的另一个目的在于提供一种诊断系统和方法，其能够用于筛选源于化学的、化妆品的和制药工业领域的基因毒性化合物，作为中间产物或活性化学、化妆品和/或药物化合物的报批前期研究。

本发明的最后一个目的是提供一种诊断系统和方法，其可对很小体积的样品进行自动筛选。发明描述

本发明涉及的诊断系统包括：

-一种暴露于环境胁迫物质中便能提高报道基因活性的转化微生物，优选地暴露于基因毒性化合物下。这种微生物含应激可诱导型启动子序列，优选地是基因毒性化合物可诱导型启动子序列。此启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，此核酸序列编码报道分子，报道分子产生可供检测的信号。

-一种转化的微生物，其含组成型和非应激诱导型启动子序列，优选地，为不能得到基因毒性化合物诱导的组成型启动子序列，所述启动子序列与编码报道基因的核酸序列有效连接，该序列编码产生可检测的信号的报道分子。

优选的，两种转化微生物是生物发光微生物，可检测的信号是光的产生。其它可用的有过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-gal和gus的遗传序列，因色谱改变或产生化学发光，其信号可利用比色分析仪或光电倍增器来检测。

有利地，根据此发明的诊断系统由两种转化的生物发光微生物组成，第一种生物发光微生物在基因毒性化合物存在时是“激活的”，产生可供检测的光信号；相反，另一种生物发光微生物中，光的产生不受样品中基因毒性化合物存在的影响。

编码报道分子的核酸序列产生可检测的光信号，这在本领域已早有描述。优选的，根据本发明的转化的生物发光微生物含有萤光素酶A和B基因，也被确认为表达性的lux基因复合体，其含有luxA和luxB基因或翻译性luxAB融合基因。转化的生物发光微生物也可包含萤光素酶C，D和E基因，这些基因是产生用于循环的有限脂肪酸底物所必需的。