[发明专利]固定化α-葡糖基转移酶制备帕拉金糖

说明书

本发明属生物技术中的酶工程，涉及微生物细胞固化技术及固化酶的工业利用。

帕拉金糖，学名为异麦芽酮糖（Isomaltulose）是一种不产生龋齿，有益于健康的甜味剂，该糖是蔗糖的同分异构体，可以利用α-葡糖基转移酶（α-glucosyltransferase）转化蔗糖来获得帕拉金糖，该酶存在于某些微生物菌种的细胞周质中，工业上通常采用固定化酶技术生产帕拉金糖，其工艺包括，选择某种含有α-葡糖基转移酶的菌种，经发酵增殖菌体细胞，将经离心的菌体细胞固定化，将蔗糖溶液流加到装有固定酶的反应柱，使蔗糖转化为帕拉金糖，再将帕拉金糖转化液浓缩后使其结晶而获得帕拉金糖产品。目前各国在帕拉金糖的生产中已形成了多个具体的技术方案。美国专利（U.Spat.No.435931）公开了一种用固定化整个细胞生产帕拉金糖的方法，该专利使用E.rhapontici NCPPB1578菌株，其培养基为蔗糖4%、蛋白胨1%，牛肉抽提物0.4%，细胞于培养基中培养70小时，在稳定期收获细胞，细胞得率为1%（WWC%），固化技术为：海藻酸钠用量5%，0.1MCaCl₂，于30℃下搅拌1小时，将固化细胞装在有夹层的φ5×30cm柱中，流速为空柱体积的0.01（V-0.01ecv/h，empty column Volumn/h）蔗糖转化为帕拉金糖和其他糖达到平衡，其酶活性为0.325g产物/g湿细胞·小时。美国专利（U.S.Pat.NO.4390627）提出了一种固定化含有α-葡萄基转移酶的P.rubrum菌整个细胞的方法包括使用单宁（Tannic Acid）吸附，加聚乙烯亚胺（polyethylemine）絮凝，再加入表卤醇/多胺聚合物（epihalohydrin/polyamine Copolymer）和戊二醛（glutaraldehyde）于培养液中，得到反应产物，过滤或离心浓缩收集湿菌饼，于55℃下干燥即得固化细胞，该专利的聚合物要求使用美国市售商标为BETZ1180的产品。英国专利（U.K.Fat.Appl.GB.NO.2082591）又提出一种改进的固定化α-葡糖基转移酶的方法，将具有α-葡糖基转移酶的微生物细胞包埋于海藻酸钙中后用聚乙烯亚胺和戊二醛处理，该专利使用S.Plymuthica菌、培养基为蔗糖5%，玉米浆3%，Na₂HPO₄0.3%，NaCl 0.2%，用30升罐装15升发酵培养基，在28℃下培养16小时，经离心浓缩收获细胞浆，再用海藻酸钙包埋固化。上述技术普遍存在下述问题：（1）在细胞发酵时一次供给营养源，造成细胞得率低，一般只有1～3%（WWC%）;（2）固化方法所用材料有特定要求，价格贵（U.S.Pat.NO4390627），并且一般获得的固化酶酶活较低，导致实际在反应柱中帕拉金糖转化液流速低，转化时间长，难以提高帕拉金糖的产量。

本发明针对上述现有技术的问题，提出一种改进的利用固定化酶转化并制备帕拉金糖的新方法。该方法以简化的工艺，便宜易得的材料，制备具有较高得率和酶活的固化酶，提高帕拉金糖的转化率和产量并降低成本，使其便于推广应用。

本发明的方法，包括对含有α-葡糖基转移酶的菌种进行发酵使其增殖细胞，离心浓缩收获细胞后，将收集的细胞固定化制成固定化酶（或称固化细胞），将固化酶装入反应柱，流加蔗糖溶液，使其转化成帕拉金糖液，再将帕拉金糖转化液浓缩、结晶或直接凝固、干燥而制得帕拉金糖产品，本发明的特点之一在于菌种在培养基中发酵培养时采用边发酵边流加营养源的方法促进菌种细胞增殖，以制备α-葡糖基转移酶（α-glucosyltanferase），所使用的菌种为Serratiaplymuthica菌种（该菌种保存于美国标准菌库（ATCC），其标准样品号码为ATCC15928）的培养物，采用的菌种发酵培养基组分含1～6%（W/V）蔗糖、0.5～5%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.01～0.4%（W/V）KCl，流加的营养源为浓度为1～7%的酵母膏或浓度1～8%的玉米浆（过滤除去沉淀物）（氮源），以及浓度1～15%的蔗糖溶液，流加方式可为连续流加或间隔流加。下述为一组较好的参数指标，培养基组分：2%（W/V）蔗糖、2%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.2%（W/V）KCl，连续流加或间隔流加浓度为2～3%的酵母膏或2%的玉米浆（过滤除去沉淀物）以及2%的蔗糖溶液。

其工艺条件为：可用任何容积发酵培养菌种以增殖细胞，发酵过程温度为25～35℃，pH5.0～8.5，搅拌，在1～20小时内边发酵边流加营养源，发酵时间为8～24小时，于对数生长期收获菌体细胞。