[发明专利]分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物

说明书

本发明提供了一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物，涉及基因检测领域。该用于分析MSI的标志物包括分别位于SULF2、SEC31A、TGFBR2、EIF4E3、ACVR2A、TAOK3、DIDO1和UBAC2基因的标志物。本发明提供的检测方法基于熔解曲线分析法，具有分析速度快、成本低和准确度高等优点。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其是涉及一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物。

背景技术

微卫星（microsatellite，MS）是遍布于人类基因组中以少数几个核苷酸（多为1~6个）为单位串联重复的DNA序列，也被称为短串联重复序列（short tandem repeat，STR），有单核苷酸、双核苷酸或多核苷酸重复，重复次数为5~50次。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，被称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。研究表明，MSI是由错配修复（MMR）基因发生缺陷引起的现象，与肿瘤的发生密切相关。MMR蛋白功能缺陷同时也会导致基因组呈现高突变表型，进而导致肿瘤发生风险增加。目前，MSI检测被美国国立综合癌症网络（NationalComprehensive Cancer Network，NCCN）结直肠癌临床实践指南及中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结肠直肠癌（colorectal，CRC）患者。MSI检测对于包括CRC和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）在内的多种实体瘤患者均具有重要临床意义。

MSI分为三类：①高频微卫星不稳定（High-frequency microsatelliteinstability，MSI-H）：2个或2个以上微卫星位点不稳定（或检测的大板标记中30％的位点不稳定）。②低频微卫星不稳定（Low-frequency microsatellite instability，MSI-L）：只有1个微卫星位点不稳定（10％～30％标记位点不稳定）。③微卫星稳定（Microsatellitestability，MSS）：无不稳定微卫星位点（10％标记点不稳定）。

目前，多重荧光PCR-毛细管电泳法检测MSI状态是国际公认的金标准，NCCN、ASCO等国际知名机构联合推荐。同时提取同一患者的正常组织和肿瘤组织样本DNA，采用多重荧光PCR的方法对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行对比分析，能准确的给患者MSI状态进行分型。但是多重荧光PCR毛细管电泳法，耗材成本高，检测时间长，操作比较复杂。

免疫组化（IHC）方法可以对MMR相关蛋白（MLH1，MSH2，MSH6，PMS2）进行检测，需要将对应的蛋白进行荧光标记，通过显微镜观察是否在细胞内正常表达，来判断MMR是否存在缺陷。需要注意的是，以MMR蛋白/MSI检测作为初筛手段，有可能漏诊部分林奇综合征患者。MMR蛋白表达及MSI（基于不同的微卫星位点选择的DNA检测）对林奇综合征的检测敏感度分别为83%和77%~89%，提示即使对所有CRC患者进行MMR或MSI普筛，也可能存在高达10%的漏诊率由于需要肉眼观察，对观测者要求比较高，同时方法本身灵敏度相对金标准稍微低一些，因此，临床一般采用金标准毛细管电泳法为主，免疫组化为辅助。

二代测序（NGS）方法可以作为MSI检测的一种手段，通过构建文库，利用二代测序仪对文库进行测序，再用生信算法对MSI位点进行分析，判断MSI长度是否发生变化，来推断MSI位点是否存在不稳定。但是二代测序的检测耗时比较长，成本高，随着测序技术不断的革新，仍在不断的探索中。

上述的几种检测MSI的方法各有所长，也各有缺点，当下迫切需要一种可以博采众长，既省时省力又节约成本，高精度，操作简单，实现MSI状态的检测方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容