[发明专利]L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用

说明书

本发明提供了一种L‑氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。其中，二肽合成方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L‑氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到二肽。利用本申请的L‑氨基酸连接酶，能够进行多种功能二肽的合成，底物谱较广，且合成效率较高，能够较好地用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。

技术领域

本发明涉及酶技术领域，具体而言，涉及一种L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。

背景技术

二肽是最简单的肽，由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键组成。尽管二肽的结构简单，但它具有广泛的生物活性，能够对生物体的生理代谢等生命活动起到调节作用。以抗生素、抗病毒、抗癌、激素及免疫调节作用为基础的肽需求量逐年增加，并广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。比如肌肽（Carnosine，β-alanyl-His）具有抗氧化、抗炎、抗糖化的作用；双甘氨肽（Gly-Gly）在医药上用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂；丙谷二肽（Ala-Gln）作为手术病人的重要营养补充剂；阿斯巴甜（Asp-Phe methyl ester）是广泛使用的一种甜味剂；Ala-Phe，Ile-Phe，Pro-Gly二肽是咸味增强剂；Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp是降压肽，Arg-Trp具有镇痛作用的，Lys-Glu具有抗肿瘤活性等等。

目前二肽合成主要是化学合成，该过程涉及到保护和去保护相关操作的过程，且产物会发生消旋，而且合成成本较高，甚至需要有毒试剂等问题。而采用生物法合成则具有很好的立体选择性，不产生消旋产物。L-氨基酸连接酶可以在ATP参与下将两个游离氨基酸连接合成二肽。现有的L-氨基酸连接酶（Lal）底物谱较窄，且在合成二肽的反应中底物浓度较低，底物浓度提高以后，酶的活性不足，这严重限制了Lal在合成多种功能二肽上的广泛应用。因而，开发具有广泛底物谱的L-氨基酸连接酶对二肽合成具有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种L-氨基酸连接酶在二肽合成上的应用、及其制备方法，以解决现有技术中L-氨基酸连接酶底物谱较窄的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种制备二肽的方法，方法包括利用如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶进行二肽合成反应，得到二肽。

进一步地，二肽合成反应的底物为氨基酸；优选地，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸中的一种或两种。

进一步地，二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly或Ala-Gln。

进一步地，二肽合成反应的反应体系包括：pH值为8.5-9.0的如下缓冲液：0.1-0.2M Tris-HCl、0.1-0.2M ATP及0.1-0.2M MgCl2。

进一步地，二肽合成反应的反应温度为20-25℃。

进一步地，二肽合成反应的反应时间为15-17h。

进一步地，进行二肽合成反应的L-氨基酸连接酶在反应体系中的质量浓度为0.05-1mg/mL。

进一步地，进行二肽合成反应的底物在反应体系中的浓度为10-200 mM。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种L-氨基酸连接酶的制备方法，其特征在于，将编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的L-氨基酸连接酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌中，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶的表达，得到培养液；将培养液进行超声破碎后离心，得到L-氨基酸连接酶。