[发明专利]一种用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒包含四对引物：

ZYMV-D-F，如SEQ ID NO.1所示；

ZYMV-D-R，如SEQ ID NO.2所示；

TuMV-D-F，如SEQ ID NO.3所示；

TuMV-D-R，如SEQ ID NO.4所示；

BBWV-2-D-F，如SEQ ID NO.5所示；

BBWV-2-D-R，如SEQ ID NO.6所示；

CMV-D-F，如SEQ ID NO.7所示；

CMV-D-R， 如SEQ ID NO.8所示；

所述四种蔬菜病毒分别为ZYMV、TuMV、BBWV-2和CMV。

2.根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述引物可以独立包装或正向引物、反向引物分别混装。

3. 根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒中还包含：2xPCR Mix和ddH₂O。

4.根据权利要求1所述的用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒为多重RT-PCR试剂盒。

5.根据权利要求4所述的用于检测四种蔬菜病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR试剂盒包含分别混装的正向引物和反向引物；其中，

ZYMV-D-F、TuMV-D-F、BBWV-2-D-F、CMV-D-F正向引物的配比为5：15：4：3；

ZYMV-D-R、TuMV-D-R、BBWV-2-D-R、CMV-D-R反向引物的配比为5：15：4：3。

6.一种同时检测四种蔬菜病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）提取待测样品的总RNA，反转录获得样品cDNA；

（2）采用如权利要求1-5任一项所述RT-PCR试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，获得扩增产物；

（3）对扩增产物进行电泳检测，若扩增产物中出现738bp大小的条带，则样品中含有ZYMV；若扩增产物中出现388bp大小的条带，则样品中含有TuMV；若扩增产物中出现533bp大小的条带，则样品中含有BBWV-2；若扩增产物中出现964bp大小的条带，则样品中含有CMV。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，多重PCR反应的反应体系为20µl，包含：模板2µl、混合后正向引物（F）1µl、混合后反向引物（R）1µl、2 x PCR Mix10µl、ddH2O4µl。

8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，多重PCR反应的条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。