[发明专利]基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法

权利要求书

1.基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、肿瘤类器官建立，包括取样及保存、样本酶解、类器官铺板、类器官传代、类器官冻存；

S2、对候选新抗原疫苗进行初步筛选，包括通过流式细胞术和ELISpot，检测被待筛选的候选新抗原疫苗刺激的PBMC中的免疫细胞的活化水平，从而初步验证和筛选高免疫原性的候选新抗原疫苗，形成初步筛选的新抗原疫苗；

S3、免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC中的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中建立免疫微环境肿瘤类器官模型；

S4、通过杀伤实验筛选能引起免疫细胞杀伤效果的个体化新抗原疫苗，包括利用步骤S3中构建的免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验，进一步体外筛选高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。

2.权利要求1所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：

S11：取样及保存，手术室新鲜切除的肿瘤组织或者活检组织放于冰预冷的adDMEM/F12+++培养基中迅速转运到实验室开始分离原代组织；

S12：样本酶解，将S11的组织块切成1-3mm³的小块，用组织解离液进行解离，不同癌组织解离液不同，解离完成的原代细胞用adDMEM/F12+++清洗重悬后用70µm或100µm细胞滤网进行过滤，过滤完成后加入红细胞裂解液4℃处理5min；

S13：类器官铺板，将裂解后的肿瘤原代细胞重悬在培养基稀释的基质胶中，整体浓度不能低于70%，将混有原代肿瘤细胞的基质胶滴加到37℃培养箱预热的6孔板上，待3-5min后迅速放置到培养箱倒置培养20min以形成稳定的dome并使基质胶凝固，待基质胶凝固后在培养皿中加入完全培养基，不同癌组织完全培养基不同；

S4：类器官冻存，待细胞状态较好时进行换液，隔天冻存，取用时复苏即可。

3.权利要求1所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于，步骤S2具体包括，

S21、初筛选环境准备：癌患者PBMC来源的免疫细胞获取，候选新抗原疫苗与PBMC共培养，以对PBMC中免疫细胞进行刺激；

S22、ELISpot实验验证对被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验，通过检测IFNγ的分泌来分析候选新抗原疫苗的免疫原性，根据数值的大小排序筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；

S23、流式细胞术验证被新抗原疫苗刺激后的免疫细胞的免疫活性：在PBMC被候选新抗原疫苗刺激三个周期后，收集PBMC并通过流式细胞术检测T细胞激活标记物评估免疫细胞的免疫活性，检测CD8+T细胞的IFNγ，CD107α，CD137的表达作为T细胞激活的指标，根据测定指标的大小排序并筛选出免疫原性较高的候选新抗原疫苗；

S24、综合评价：对S22和S23筛选出的候选新抗原疫苗，进行综合评价，进一步筛选形成初步筛选的新抗原疫苗。

4.权利要求2所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：步骤S3具体包括，

S31，利用步骤S1冻存的类器官进行传代培养，复苏S1冻存的类器官，从含有类器官的6孔板中吸出培养基，每孔含有1-5×10⁴个类器官，按类器官传代方式进行消化，待解离成单细胞后，用CFSE标记肿瘤类器官；

S32，免疫微环境肿瘤类器官模型建立，用步骤S2中初步筛选的新抗原疫苗刺激步骤S1病人来源的PBMC中的免疫细胞，把刺激后的PBMC与CFSE标记的类器官共培养于T细胞培养基中，按免疫细胞比肿瘤类器官细胞10:1的比例进行混合，铺到24孔板中，每孔加500µL培养基，免疫微环境肿瘤类器官模型建立完成，备用。

5.权利要求4所述的基于肿瘤类器官模型筛选个体化肿瘤新抗原疫苗的方法，其特征在于：步骤S4利用免疫微环境肿瘤类器官模型进行类器官杀伤实验具体为，对免疫微环境肿瘤类器官模型培养72h，后收集类器官和T细胞，在室温下用CD45抗体、AnnexinV抗体、7-AAD抗体染色15分钟，用流式细胞仪分析CFSE标记的类器官的凋亡水平，CFSE+CD45-用于定义类器官，AnnexinV-7-AAD-用于检测肿瘤类器官杀伤的细胞凋亡水平，根据不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤后的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗，或者，用光学显微成像，分析类器官杀伤实验候选新抗原疫苗激活免疫细胞的免疫杀伤效果，对不同个体化新抗原疫苗激活的免疫细胞杀伤引起的类器官凋亡水平的高低进行排序，筛选出高免疫原性的肿瘤治疗性疫苗。