[发明专利]D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明基于CRISPRi筛选技术来识别内源性基因靶点，提供一种高产D‑泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明证实CRISPRi筛选可以得到对DPA合成有益的基因靶点；运用CRISPRi技术，筛选识别内源性基因靶点大幅度提高基因工程菌D‑泛酸生物合成能力，菌株DPAP10/pdCas9gRNA‑gltA‑ptsH相对于原始菌株DPAP10，在摇瓶中DPA产量提高了49.5％达到5.3g/L；中间代谢物检测分析发现，改变丙酮酸通量分布和降低TCA循环速率，会导致碳流更多流向DPA合成代谢路径中，从而提高DPA的产量，这一发现为构建更高产菌株提供了新思路。

(一)技术领域

本发明涉及一种基于CRISPRi筛选的产D-泛酸基因工程菌及构建方法，及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

(二)背景技术

泛酸，也称为维生素B5，是辅酶A的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，D-泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。在已知的D-泛酸合成方法中，生物发酵法生产D-泛酸具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产D-泛酸仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。因此，构建一株更高产的D-泛酸菌株仍是一大挑战。

(三)发明内容

本发明的目的是基于CRISPRi筛选技术来识别内源性基因靶点，提供一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种基于CRISPRi筛选的产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：

(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc-EcilvD，记为工程菌DPAP7；

(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanB基因拷贝数，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc-BspanB，记为工程菌DPAP8；

(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc-CgpanC，记为工程菌DPAP9；

(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc-alsS，记为工程菌DPAP10；

(5)制备工程菌DPAP10的高压电穿孔法感受态细胞DPAP10/pdCas9，设计pTarget同时含有gRNA-gltA和gRNA-ptsH，将含有gRNA-gltA-ptsH的pTarget电转入DPAP10/pdCas9，得到工程菌DPAP10/pdCas9gRNA

-gltA-ptsH，即为所述产D-泛酸的基因工程菌。

本发明在底盘菌ZJUTDPAL5(E.coli W3110，Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA/Trc-lpd/Δglk/ilvA*/Trc-pck/Trc-maeB/Trc-ilvBN/gdhA*^T，已在CN113637618A中公开)的基础上，综合运用系统代谢工程策略，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过基因敲入引入异源基因，增强大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径中关键基因表达水平，构建无质粒、无抗生素使用的D-泛酸生产菌株DPAP10，再运用CRISPRi筛选技术、代谢通量的优化等方式，构建了一株性能更优的D-泛酸生产菌株。