[发明专利]D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用在审

专利信息
申请号: 202310695247.9 申请日: 2023-06-13
公开(公告)号: CN116622609A 公开(公告)日: 2023-08-22
发明(设计)人: 柳志强;张博;贺周霖;唐蒙娜;肖云颖;沈盼;郑裕国 申请(专利权)人: 浙江工业大学
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/113;C12P13/02;C12R1/19
代理公司: 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 代理人: 冷红梅
地址: 310014 浙*** 国省代码: 浙江;33
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 泛酸 基因工程 构建 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种基于CRISPRi筛选的产D-泛酸的基因工程菌,由如下方法构建获得:

(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌,在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数,得到工程菌DPAL6 derivative,

yjiV::Ptrc-EcilvD,记为工程菌DPAP7;

(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanB基因拷贝数,得到工程菌DPAP7 derivative,flik::Ptrc-BspanB,记为工程菌DPAP8;

(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数,得到工程菌DPAP8 derivative,

ompT::Ptrc-CgpanC,记为工程菌DPAP9;

(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数,得到工程菌DPAP9 derivative,

yjiP::Ptrc-alsS,记为工程菌DPAP10;

(5)制备工程菌DPAP10的高压电穿孔法感受态细胞DPAP10/pdCas9,设计pTarget同时含有gRNA-gltA和gRNA-ptsH,将含有gRNA-gltA-ptsH的pTarget电转入DPAP10/pdCas9,得到工程菌DPAP10/pdCas9gRNA-pgk-ptsH,即为所述产D-泛酸的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于:所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanB、CgpanC、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~4所示,所述gRNA-gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述gRNA-ptsH核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法,所述方法包括:

(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV,增强EcilvD的表达强度,

得到工程菌DPAL6 derivative,yjiV::Ptrc-EcilvD,记为工程菌DPAP7;

(2)以工程菌DPAP7为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanB基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik,增强BspanB的表达强度,得到工程菌DPAP7 derivative,flik::Ptrc-BspanB,记为工程菌DPAP8;

(3)以工程菌DPAP8为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT,增强CgpanC的表达强度,得到工程菌DPAP8 derivative,ompT::Ptrc-CgpanC,记为工程菌DPAP9;

(4)以工程菌DPAP9为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP,增强alsS的表达强度,得到工程菌DPAP9 derivative,yjiP::Ptrc-alsS,记为工程菌DPAP10;

(5)制备工程菌DPAP10的高压电穿孔法感受态细胞DPAP10/pdCas9,设计pTarget同时含有gRNA-gltA和gRNA-ptsH,将含有gRNA-gltA-ptsH的pTarget电转入DPAP10/pdCas9,得到工程菌DPAP10/pdCas9gRNA-gltA-ptsH,即为所述产D-泛酸的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的基因工程菌方法,其特征在于:所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanB、CgpanC、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~4所示,所述gRNA-gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述gRNA-ptsH核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于浙江工业大学,未经浙江工业大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202310695247.9/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top