[发明专利]D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用在审
申请号: | 202310695247.9 | 申请日: | 2023-06-13 |
公开(公告)号: | CN116622609A | 公开(公告)日: | 2023-08-22 |
发明(设计)人: | 柳志强;张博;贺周霖;唐蒙娜;肖云颖;沈盼;郑裕国 | 申请(专利权)人: | 浙江工业大学 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/113;C12P13/02;C12R1/19 |
代理公司: | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人: | 冷红梅 |
地址: | 310014 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 泛酸 基因工程 构建 方法 应用 | ||
1.一种基于CRISPRi筛选的产D-泛酸的基因工程菌,由如下方法构建获得:
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌,在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数,得到工程菌DPAL6 derivative,
yjiV::Ptrc-EcilvD,记为工程菌DPAP7;
(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanB基因拷贝数,得到工程菌DPAP7 derivative,flik::Ptrc-BspanB,记为工程菌DPAP8;
(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数,得到工程菌DPAP8 derivative,
ompT::Ptrc-CgpanC,记为工程菌DPAP9;
(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数,得到工程菌DPAP9 derivative,
yjiP::Ptrc-alsS,记为工程菌DPAP10;
(5)制备工程菌DPAP10的高压电穿孔法感受态细胞DPAP10/pdCas9,设计pTarget同时含有gRNA-gltA和gRNA-ptsH,将含有gRNA-gltA-ptsH的pTarget电转入DPAP10/pdCas9,得到工程菌DPAP10/pdCas9gRNA-pgk-ptsH,即为所述产D-泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于:所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanB、CgpanC、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~4所示,所述gRNA-gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述gRNA-ptsH核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法,所述方法包括:
(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV,增强EcilvD的表达强度,
得到工程菌DPAL6 derivative,yjiV::Ptrc-EcilvD,记为工程菌DPAP7;
(2)以工程菌DPAP7为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanB基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik,增强BspanB的表达强度,得到工程菌DPAP7 derivative,flik::Ptrc-BspanB,记为工程菌DPAP8;
(3)以工程菌DPAP8为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT,增强CgpanC的表达强度,得到工程菌DPAP8 derivative,ompT::Ptrc-CgpanC,记为工程菌DPAP9;
(4)以工程菌DPAP9为出发菌株,运用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术,将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP,增强alsS的表达强度,得到工程菌DPAP9 derivative,yjiP::Ptrc-alsS,记为工程菌DPAP10;
(5)制备工程菌DPAP10的高压电穿孔法感受态细胞DPAP10/pdCas9,设计pTarget同时含有gRNA-gltA和gRNA-ptsH,将含有gRNA-gltA-ptsH的pTarget电转入DPAP10/pdCas9,得到工程菌DPAP10/pdCas9gRNA-gltA-ptsH,即为所述产D-泛酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的基因工程菌方法,其特征在于:所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanB、CgpanC、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~4所示,所述gRNA-gltA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述gRNA-ptsH核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
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