[发明专利]一种通过控制糖多孢红霉菌胞内NADH水平提高红霉素产量的诱导表达系统、菌株及应用

说明书

本发明涉及合成生物学技术领域，提供了一种通过控制糖多孢红霉菌胞内NADH水平提高红霉素产量的诱导表达系统，包括SACE_1905基因构建的质粒pSETcd‑1905‑cmt‑sgRNA；其中，所述SACE_1905基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种红霉素高产工程菌株及其应用，所述菌株包括上述诱导表达系统。本发明基于SACE_1905和菌株初级生长与次级代谢的相关性，通过合成生物学方法，借助“CRISPRi技术”和“可诱导系统”设计并构建动态控制胞内还原力的诱导系统，为工业生产提高红霉素产量提供技术支持。

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域，尤其涉及一种通过控制糖多孢红霉菌胞内NADH水平提高红霉素产量的诱导表达系统、菌株及应用。

背景技术

糖多孢红霉菌是一类广谱型大环内酯类抗生素-红霉素(Erythromycin)的主要产生菌，在工业生产红霉素中具有重要作用。由于放线菌内大多数生物合成基因簇在常规实验条件下是静默的，其抗生素产量并不十分理想。目前，“针对糖多孢红霉菌进行基因工程改造优化次级代谢过程，从而提高红霉素发酵产量的策略”应用广泛。然而，这种静态调控会导致细胞内某种物质的缺乏或冗余，从而使产量受到限制。为了改善这种局限性，近年来，“一种通过设计与构建基因通路单元，使重组细胞可以动态地感应并处理特定信号进而进行适应性调控的动态调控策略”被提出。

研究表明，在阿维链霉菌中，NADH可减弱阿维菌素合成负调控因子Rex对靶基因的抑制，促进阿维菌素的生物合成；在糖多孢红霉菌中，过表达NADH氧化酶或过表达ATP酶基因，可导致菌株胞内NADH/NAD⁺比值下降，红霉素产量上升。红霉素的生物合成涉及一系列的氧化还原反应，其中需要NADH或NADPH依赖性酮还原酶、烯酰还原酶、醛酮还原酶等诸多酶的参与。可以看出，NADH是红霉素生物合成酶的重要辅因子，其胞内水平与红霉素合成紧密相关，因此，控制生产菌株的胞内还原力水平也可能是一种提高红霉素产量的有效策略。

放线菌的生长曲线主要分为三个阶段：短暂的初级代谢阶段，转换阶段和漫长的次级代谢阶段。然而，由于放线菌从初级代谢到次级代谢往往需要复杂的转换过程阶段，这严重影响其次级代谢产物的生物合成产量。因此，从初级代谢与次级代谢转换着手，控制两者间的转换阶段是优化次级代谢产物产量的关键点。本实验室前期发现，SACE_1905基因编码乙醇脱氢酶，增加其基因拷贝数可一定程度地提高菌株的初级生长和红霉素产量，暗示SACE_1905在糖多孢红霉菌初级代谢与次级代谢中扮演重要角色。

据此，本发明尝试通过构建SACE_1905诱导表达系统，并对菌株胞内NADH水平进行动态控制，平衡菌株的初级生长与次级代谢，从而更进一步地提高红霉素产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种通过控制糖多孢红霉菌胞内NADH水平提高红霉素产量的SACE_1905诱导表达系统、菌株及应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种通过控制糖多孢红霉菌胞内NADH水平提高红霉素产量的诱导表达系统，包括SACE_1905基因构建的质粒pSETcd-1905-cmt-sgRNA；其中，所述SACE_1905基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的优选方式之一，所述SACE_1905基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为本发明的优选方式之一，所述质粒pSETcd-1905-cmt-sgRNA的构建方法如下：

①将dCas9片段、合成DNA片段cmt插入到质粒pSET152的酶切位点，获得重组质粒pSETcd；

②将P_ermE*片段、SACE_1905基因插入到重组质粒pSETcd的酶切位点，获得重组质粒pSETcd-1905；