[发明专利]毕赤酵母表达犬重组白蛋白及其纯化方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及毕赤酵母表达犬重组白蛋白及其纯化方法。本发明提供了经密码子优化后的犬白蛋白基因、表达载体、宿主菌及其应用，所述犬白蛋白基因具备如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的宿主菌为包含所述犬白蛋白基因且能够高效表达犬白蛋白的毕赤酵母菌。本发明还提供了采用毕赤酵母经重组表达获得的犬白蛋白及经发酵生产的犬白蛋白的方法。本发明提供的犬白蛋白生产工艺简单、价格低廉、蛋白产率高、回收纯度高达97％以上，适用于工业化大规模生产重组犬白蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及毕赤酵母表达犬重组白蛋白及其纯化方法。

背景技术

犬血白蛋白(Canine serum albumin，CSA)的一级序列表明该蛋白是由584个氨基酸组成的单一多肽，CSA与HSA和BSA的成对序列同源性较高，整体结构与HSA和其他哺乳动物白蛋白的结构非常相似，由三个拓扑相同的结构域(I，残基1-196；II，残基197-383；和III，残基384-584)组成，每个结构域都分为两个子结构域。尽管结构域I-III具有对称的重复形态，但它们的不对称空间排列形成了独特的心形结构。CSA中共有35个Cys残基。结构域I中的Cys-34是唯一具有不参与17个二硫键的游离巯基的Cys，这也是血管内还原性巯基的主要来源。Cys-34使得白蛋白易于形成含半胱氨酸或谷胱甘肽的异型二硫化物。白蛋白部分变性后以Cys-34硫醇盐的形式结合金属离子。

白蛋白减少可见于以下几种情况：①合成白蛋白能力降低。肝脏为合成白蛋白的器官，肝脏的某些疾病或磷、氯仿等中毒，都可使肝合成白蛋白的能力下降，造成白蛋白降低。②长期损失白蛋白。某些肾脏疾病能使肾小球通透性增加，则白蛋白分子可通过而从尿中排出，形成蛋白尿。③患感染性疾病时，在球蛋白增加的同时，往往白蛋白下降，这可能是由于球蛋白的增加而引起的，是机体调节的结果，其作用是使机体保持血浆胶体渗透压在一定的范围内。④长期营养不足。用于合成血浆白蛋白的原料即营养物质的摄人不足，或消化道疾患，不能很好地吸收消化，缺乏制造白蛋白的原料。犬血浆白蛋白缺乏所表现的临床症状包括：①胶体渗透压紊乱出现水肿；②运输能力不足，例如氨基酸、激素、维生素等器官供应减少，同时分解代谢产物不能及时排泄出去；③循环血量与重要器官出现休克，有时甚至引起多器官慢性退行性性变。这个时候及时补充白蛋白是缓解症状的有效方法。

目前，研究报道的犬白蛋白主要来源是从犬血中分离，原料来源限制较大，成本较高

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供毕赤酵母表达犬重组白蛋白及其纯化方法，本发明提供了使用基因工程技术制备的犬重组白蛋白，产量较高，成本较低，前景可观。

本发明提供了编码犬白蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明提供了包含所述核酸的表达载体。

在一些具体实施例中，所述表达载体包括pPIC9K载体。

本发明提供了表达犬白蛋白的宿主菌，其表达所述的核酸。

优选的，所述宿主菌包括毕赤酵母菌，所述毕赤酵母菌包括毕赤酵母X-33和毕赤酵母GS115。

在一些具体实施例中，所述宿主菌为毕赤酵母X-33。

本发明还提供了所述宿主菌的构建方法，取所述的表达载体转化感受态菌株后获得所述宿主菌。

进一步的，所述宿主菌经包含0.25～5mg/mL G418的YPD培养基筛选后获得。

本发明还提供了犬白蛋白的制备方法，包括培养如下①或②所述的宿主菌，诱导所述犬白蛋白的表达：

①、所述的宿主菌；

②、所述制备方法制得的所述宿主菌。