[发明专利]长林小蠹SS-COI PCR检测引物以及检测方法

说明书

本发明公开了长林小蠹SS‑COI PCR检测引物以及检测方法。本发明根据长林小蠹完整COI序列中与近缘种差异较大的部分获得了特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。在此基础上，本发明提供了长林小蠹SS‑COI PCR检测方法以及长林小蠹SS‑COI PCR检测试剂盒，特异性检测结果表明，本发明建立的检测方法具有良好的特异性，能够特异性扩增长林小蠹，对于长林小蠹的近缘种均不能扩增，适用于长林小蠹的快速精准检测；灵敏度检测结果表明，本发明提供的长林小蠹SS‑COI PCR检测方法检测灵敏度高，检测限位DNA浓度为8.7×10supgt;‑2/supgt;ng/μL。

技术领域

本发明涉及昆虫PCR检测引物以及检测方法，尤其涉及长林小蠹SS-COI PCR检测引物以及检测方法，属于长林小蠹分子检测领域。

背景技术

长林小蠹(Hylurgus ligniperda Fabricius)(鞘翅目Coleoptera：象甲科Curculionidae)是中国新入侵的重要害虫，在山东省泰安市、烟台市、青岛市和威海市成功定殖且造成严重危害。长林小蠹在外部形态特征方面与华山松大小蠹、云杉大小蠹、纵坑切稍小蠹等种类十分相似，需要专业的昆虫分类学家进行种类识别与鉴定，难以满足口岸、海关及林业一线人员开展检疫工作的实际需求，十分不利于外来入侵种检疫管理及应急处置，亟需研发长林小蠹快速精准检测识别技术，以实现外来入侵种早期识别的重要目标，这对防止外来种侵害和生物安全起着十分重要的作用。

在采用PCR技术进行长林小蠹检测时，需要筛选得到高特异性和高灵敏度的PCR引物，才能实现长林小蠹快速、精准检测和识别。

发明内容

本发明的目的之一是提供长林小蠹SS-COI PCR检测引物；

本发明的目的之二是提供一种长林小蠹SS-COI PCR检测方法；

本发明的目的之三是提供一种长林小蠹SS-COI PCR检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了长林小蠹SS-COI PCR检测引物，其中，所述长林小蠹SS-COIPCR检测引物由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成。

本发明的另一方面是提供了长林小蠹SS-COI PCR检测试剂盒，包括：2×FlashPCR MasterMix，长林小蠹SS-COI PCR检测引物，ddH₂O；其中，所述长林小蠹SS-COI PCR检测引物由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示下游引物组成

本发明的另一方面是提供了一种长林小蠹SS-COI PCR检测方法，包括：

(1)提取待检测样品DNA；

(2)以待检测样品DNA为模板，以长林小蠹SS-COI PCR检测上游引物HLSSCOIF和下游引物HLSSCOIR建立PCR扩增体系并进行PCR扩增反应；

(3)若待检测样品出现474bp的扩增条带，则待检测样品为长林小蠹。

作为本发明优选的具体实施方式，步骤(2)中所建立的PCR扩增体系为：2×FlashPCR MasterMix(Dye)12.5μL、上游引物HLSSCOIF 1μL、下游引物HLSSCOIR 1μL、基因组DNA模板1.5μL、ddH₂O 9μL。

作为本发明的一种优选的具体实施方式，步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s，94℃变性10s，54℃或55℃退火15s，72℃延伸15s，共34个循环，最后72℃延伸1min。