[发明专利]基于CRISPR/Cas12a的DNA快速检测试剂及其检测方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR/Cas12a系统实现快速检测DNA的检测试剂和检测方法，该检测试剂通过将完整的crRNA分裂成茎环RNA和间隔RNA，当两段RNA重组后，具有与完整crRNA相同甚至更优的活性。使用该方法，针对不同的靶DNA进行检测时，仅需更换20nt的间隔序列即可完成核酸蛋白复合物(RNP)的制备。整个过程使用方便，耗时较短，可大幅度节省RNA合成的成本。此外，相较完整的crRNA，短RNA序列的稳定性更强，更适用于检测试剂盒的开发和应用，HPV检测验证实验的检测准确率达到100％。

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas12a的DNA快速检测试剂及其检测方法，属于基因检测及分子诊断领域。

背景技术

CRISPR系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源遗传物质。Cas12a的结构生物学研究揭示了其整体分子结构、以及对靶DNA的识别机制。该酶具有双叶结构，其中由α螺旋结构域REC1和REC2组成N末端REC叶片，并通过楔形(WED)结构域连接到包含PAM相互作用(PI)的C末端NUC叶片、桥螺旋(BH)、RuvC、以及Nuc结构域。crRNA通过序列和形状特异性与Cas12a结合，并导致crRNA中种子序列的重排，进而启动Cas12a/crRNA核酸蛋白复合物(RNP)识别目标DNA。近年来，基于Cas12a系统已开发出许多技术，如多基因编辑、转录/表观遗传调控、单碱基编辑器等，在人类、动植物、微生物等多物种中都得到了广泛应用。

Cas12a/crRNA RNP与目标dsDNA结合后形成的复合物晶体结构表明，目标DNA的非靶链(NTS)被静电引导至RuvC结构域中的催化位点，从而促进NTS和靶标DNA链(TS)的顺序切割。进一步实验证明，在Cas12a切割靶DNA后，PAM近端DNA切割产物仍与RNP结合，从而将Cas12a维持在催化激活状态，并能够切割反应体系中非靶单链DNA。上述通过crRNA指导的、靶DNA链激发的ssDNA非特异性切割活性，称为反式切割活性(Trans-cleavage activity)。

最近，基于Trans剪切活性开发CRISPR/Cas12a检测方法已成为体外诊断领域的研究热点。如Jennifer A.Doudna课题组通过将Cas12a检测与等温扩增(RPA)技术相结合，创建了一种名为DETECTR的核酸检测方法，实现了对病毒DNA的灵敏检测。然而，目前基于CRISPR/Cas12a系统开发的核酸检测方法均使用含有完整crRNA的Cas12a RNP，需大批量化学合成crRNA，具有成本高、稳定性较差的缺点。

因此，现在仍需要一种不同于传统的DNA检测方法，尤其是无需crRNA即可实现DNA的快速、灵敏检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是基于CRISPR/Cas12a系统实现直接检测DNA，从而实现DNA的快读、灵敏检测。

基于上述原因，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a的DNA快速检测试剂，其中，该试剂包括适用于DNA的CRISPR/Cas12a检测体系。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于DNA快速检测的CRISPR/Cas12a检测试剂，包括：重组Cas12蛋白、茎环RNA、间隔RNA和荧光探针、buffer。该检测试剂中，通过将完整的crRNA分裂成茎环RNA和间隔RNA，当两段RNA重组后，具有与完整crRNA相同甚至更优的活性。间隔RNA与待测的靶DNA互补配对，当靶DNA存在时，可激活Cas12a的反式切割活性，进而剪切含有FAM荧光基团的单链DNA探针，产生可被检测的荧光信号。

优选地，上述用于DNA快速检测的CRISPR/Cas12a试剂中的重组Cas12蛋白来源于Acidaminococcus sp菌株的AsCas12a。

更优选地，上述重组Cas12蛋白获取步骤如下：