[发明专利]分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用。本发明首先以SVA CH/FJ/2017毒株基因序列为基础，构建SVA VP2蛋白重组表达质粒pET28a‑SVA‑VP2；然后将pET28a‑SVA‑VP2重组质粒与分子伴侣pTf16质粒共同转入BL21(DE3)感受态细胞，成功制备了可溶性的的重组SVA VP2蛋白；所述重组VP2蛋白在体内、外试验中均具有良好的免疫原性，能够引发机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，为SVA亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了试验材料和理论依据。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用。

背景技术

A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)隶属小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，是一种新发猪传染病病原。SVA主要感染猪，且对不同年龄阶段的猪都易感，主要引起母猪严重的水疱病和新生仔猪的死亡，新生仔猪病死率高达30％～70％。SVA感染后主要临床症状为猪鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮肤、黏膜出现水疱样病变，与口蹄疫(FMD)、猪水疱疹(VES)、猪水疱病(SVD)和水疱性口炎(VS)引起的病变极为类似，临床上难以区分。猪塞内卡病毒病的暴发与流行已给全球养猪业造成了较大的经济损失。

相比较其它病原，SVA的研究较少，在蛋白免疫原性方面也处于起始阶段。虽然已有报道关于SVA的灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种候选疫苗的研究进展，但目前仍无商品化疫苗用于预防SVA感染。SVA感染动物机体后，可以同时激活机体的B细胞和T细胞应答，从而产生大量的中和抗体抵抗和清除SVA的感染。已有研究证实小鼠是初步评价SVA疫苗免疫原性和保护效果的候选动物模型；孟媛等利用重组SVA VP1蛋白联合佐剂免疫小鼠评价了其免疫应答效果；崔川等融合表达了SVA VP2蛋白并在免疫VP2蛋白的小鼠血清中检测到高水平的特异性抗体和IFN-γ、IL-2细胞因子含量。SVA VP2结构蛋白作为诱导机体生成中和抗体的优势抗原，是SVA亚单位疫苗和诊断制剂研究候选抗原之一，制备可溶性、高活性的重组VP2蛋白是亚单位疫苗研究的关键。

通过体外表达系统制备重组蛋白时，大肠杆菌表达系统因操作简单、生产成本低、表达量高等优点常为首选的表达系统，但大多重组蛋白多以包涵体形式表达，主要原因是蛋白在形成过程中快速聚集，肽链折叠时间短，造成肽链折叠不充分、不完全，从而产生异常构象，形成包涵体。先前的研究表明SVA VP2蛋白的外源性表达多以包涵体形式存在，可能导致蛋白质无法正确折叠，从而影响其正常生物学功能。其中张永宁等和崔川等通过在VP2蛋白的编码基因中添加融合标签，分别利用原核表达载体pET-30a和pET-32a制备了可溶性表达的SVA VP2蛋白，但这种方式制备的重组蛋白的分子量明显大于正常的VP2蛋白，对准确研究VP2蛋白的功能可能存在一定影响。

分子伴侣蛋白是高度保守的蛋白质，在体内促进其他蛋白质的适当折叠。不同的伴侣系统有助于蛋白质从头折叠、运输和低聚物复合物的组装，以及从应激诱导的展开中恢复。也有研究表明分子伴侣能够提高目的蛋白的可溶性表达，但是分子伴侣促进目的蛋白可溶性表达的结果也存在一定的随机性，相反可能会抑制其他酶或蛋白的可溶性表达；而且在蛋白纯化过程中分子伴侣污染现象严重。而且本发明在研究过程中发现，大多数的分子伴侣(例如pG-KJE8，pGro7，pKJE7，pG-Tf2等)均未使A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达。