[发明专利]一种重组大肠杆菌合成井冈霉烯胺的构建策略与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及了一种多基因双质粒共表达法构建生物合成井冈霉烯胺大肠杆菌工程菌的方法以及应用。本发明通过敲除积累井冈霉烯胺的前体物质7－磷酸景天庚酮糖，并将合成井冈霉烯胺所需的四个关键基因组合连接在质粒pET－28a(+)和质粒pACYC184上，将重组质粒导入敲除菌株中，成功构建异源合成井冈霉烯胺的工程菌株。随后通过SDS－PAGE电泳进行鉴定，各蛋白均有所表达。最后对井冈霉烯胺建立检测方法，利用HPLC－MS进行检测，检测到生成24.3μg/L的井冈霉烯胺。

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌合成井冈霉烯胺的构建策略和检测方法。

背景技术

井冈霉烯胺是一种C₇N不饱和氨基环醇类物质。近年来由于其具有显著的糖苷酶抑制活性，可以与水解酶中心的氨基糖苷键结合，发生竞争作用从而减缓淀粉等糖类的水解，被广泛用在临床上治疗肥胖症、脂肪、糖尿病等疾病以及农业上作为畜牧动物饲料的添加剂。目前井冈霉烯胺的生产方式主要是化学法和生物法合成。化学合成需要构建多个立体羟基和氨基手性中心，一定程度上受到立体选择性的制约和额外的保护与去保护步骤的限制。生物法相比于化学法而言，操作更为简便，立体选择性更为专一。

大肠杆菌作为异源生产小分子天然产物的重要宿主，凭借其生长迅速，易于培养以及拥有丰富的遗传操作工具等优势受到众多研究者的关注。大肠杆菌中存在合成井冈霉烯的关键作用酶氨基转移酶WecE(GenBank：QZI66021.1),因而有可能使中间产物井冈霉烯酮一步反应直接生成井冈霉烯胺，减少多步繁琐的酶促反应。

基于上述情况，申请人利用合成生物学的方法，发明了一种在大肠杆菌异源合成井冈霉烯胺的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成井冈霉烯胺重组大肠杆菌以及应用。

本发明提供了一种大肠杆菌宿主以及在该宿主中转入含合成井冈霉烯胺的关键基因vldA、shvalD、shvalK和wecE的双质粒载体的重组大肠杆菌，并用该重组大肠杆菌合成井冈霉烯胺。

所述的基因vldA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因shvalD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，基因shvalK的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，基因wecE的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的双质粒载体构建思路为基因shvalD和基因shvalK连接在质粒pET-28a(+)的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间，得到质粒载体1，基因vldA和基因wecE连接在质粒pACAY184的xbaⅠ和EcoRⅤ酶切位点之间，得到质粒载体2。

所述的大肠杆菌宿主是指敲除戊糖磷酸途径中的转醛酶基因talA和talB的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

附图说明

图1为SDS-PAGE蛋白电泳鉴定图；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

实例中，种子培养基使用LB液体进行培养，LB培养基配方如表1：

表1 LB培养基配方

发酵培养基的配方如表2：

表2发酵培养基配方

组分A与组分B单独配制，组分B在配制好后调节pH为7.0。组分A灭菌115℃，20min。组分B灭菌121℃，20min。两个组分在灭菌后混合。组分B在配好后调节PH到7.0。

微量元素的配方如表3：