[发明专利]一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光（RAA）快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合和试剂盒，可实现39℃条件下20min内完成对虾急性肝胰腺坏死病的检测；与常见的对虾白斑综合征病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、细菌性肝胰腺坏死病、肝肠胞虫、十足目虹彩病毒I型、副溶血性弧菌均无交叉反应，特异性达100％。检测方法快速、可靠、操作简便，弥补了传统检测技术的不足，可用于现场检测。本发明提供的基于RAA荧光法快速检测急性肝胰腺坏死病的方法，灵敏度高，达10supgt;2/supgt;copies/uL。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法。

背景技术

急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopannecrosis disease,AHPND)是由副溶血性弧菌携带的质粒编码PirAVP和PirBVP毒素基因引起的一种对虾疾病。由于该疫病在早期(投苗30d左右)会引起虾苗不寻常的高死亡率而被称之为早死综合征(EMS)，该病在全球虾类主要养殖地区肆虐，给越南、中国、马来西亚、泰国、墨西哥和菲律宾等国对虾产业带来巨大损失。患病对虾主要临床症状表现为肝胰腺萎缩、颜色变浅，空肠空胃，甲壳变软，失去活力等，常为急性死亡，死亡率高达100％。

我国水产养殖规模在不断扩大，集约化养殖模式快速发展，水产养殖病害形势变的非常严峻，AHPND作为一种细菌病是当前对虾养殖主要病害之一，但是当前该病主要采用，普通PCR和荧光PCR开展检测，虽然特异性强、灵敏度高，但是仪器昂贵、检测耗时长、需要专门的实验场地、检测人员要求高的问题。在海关快速通关的背景下，快速检测显得尤为重要，RAA恒温荧光检测仅需要20min，该方法可以大大压缩检测时长，因此希望开发一种AHPND的RAA快速检测方法，并且应用于进口亲虾、养殖场现场的AHPND的快速检测中。

发明内容

本发明提供了一种快速检测对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)检测方法，适用于养殖场监控、海关、水产技术推广站等部门，对AHPND病原的检测，用于解决对虾养殖中AHPND流行、传播、预防和控制的问题。

本发明首先提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)引物探针，优选的，所述引物和探针为针对PVA1中的保守序列SEQ ID NO:4设计；

更优选的，所述上游引物F为SEQ ID NO:1，下游引物R为SEQ ID NO:2，探针P为SEQID NO:3。

优选的，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基基数27bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的29位的A用四氢呋喃残基替换。

更优选的，所述荧光探针的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1；

其次，本发明提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的试剂盒，所述的检测试剂盒包含所述的引物和探针和其他RAA检测试剂。

另外，本发明提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的方法；

优选的，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：

(1)提取待检测对象的核酸样品。

(2)试剂配制：

a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中先加入25μL A Buffer、2μL上游引物F(10μM)、2μL下游引物R(10μM)，0.6μLP探针(10uM)、12.9uL的水；

b.再向检测单元管中加入5uL待检DNA核酸；c.在检测单元管盖上加入2.5uL的BBuffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀6次，随后低速离心10sec。