[发明专利]一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光（RAA）快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含了引物上游F、下游引物R和探针P组成，所述引物和探针为针对PVA1中的保守序列SEQ ID NO:4设计。

2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述上游引物F为SEQ ID NO:1，下游引物R为SEQ ID NO:2，探针P为SEQ ID NO:3。

3.如权利要求1或2所述探针，其特征在于，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5，端碱基基数27bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3，端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的29位的A用四氢呋喃残基替换。

4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。

5.一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的引物和探针和其他RAA检测试剂。

6.一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：

(1)提取待检测对象的核酸样品。

(2)试剂配制：

a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中先加入25μLABuffer、2μL上游引物F(10μM)、2μL下游引物R(10μM)，0.6μLP探针(10uM)、12.9uL的水；

b.再向检测单元管中加入5uL待检DNA核酸；c.在检测单元管盖上加入2.5uL的BBuffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀6次，随后低速离心10sec。

(3)采用ABI荧光PCR仪，对参数进行设置，荧光通道选择FAM通道，淬灭基团为None，反应程序为39℃60sec；39℃30sec，40个循环。

(4)结果判定：

阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出锋时间≤15min，为有效结果；

阴性对照：无扩增曲线出现，或出锋时间≥20min，为有效结果；有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min，判定为阳性；

无明显扩增曲线，出峰时间＞18min，判定为阴性。