[发明专利]同时检测四种鱼类病毒的重组酶聚合酶可视化扩增试纸条

权利要求书

1.一种同时检测四种鱼类病毒的RPA引物和探针，其特征在于，包括：

SVCV RPA引物F：5’-TCTGGATGGATCTGCCATGCAGCTGAA-3’；

SVCV RPA引物R：5’-GACTGATGAAGATCTGGGGTTTCCCC-3’；

SVCV检测探针：5’-TCGGATGAATACTGTGGG-3’；

IHNV RPA引物F：5’-ACATCAAGGGGGGAGTCCTCGAGGAT-3’；

IHNV RPA引物R：5’-GCGAAGGTAGCGTCTGGTGGTGCC’；

IHNV检测探针：5’-TCTCGTTCCCTCTCCTCC-3’；

EHNV RPA引物F：5’-CAGCACAGTCAGGGACATGGTCGTGGAGC-3’；

EHNV RPA引物R：5’-GACGGGAGTGGCGCAGGTGTAATTGGAG-3’；

EHNV检测探针：5’-GGTTGACCATGTGGACTGG-3’；

VHSV RPA引物F：5’-GACGAGGCAAGCAAGGATCACGAGTA-3’；

VHSV RPA引物R：5’-TCTATGAAATCAGGGTTGAGAAATTTC-3’；

VHSV检测探针：5’-TCATCCAGATGCAGGA-3’。

2.一种利用权利要求1所述的RPA引物和探针进行RPA扩增试纸的制备，其特征在于：

S1：获取待测病毒的DNA；

S2：四种病毒检测探针(10nmol/mL)取5μL，与15μL缓冲液(0.15mol/LNaOH溶液，0.015mol/L柠檬酸钠，20mmol/L EDTA溶液)混匀，室温作用10min，再分别点于硝酸纤维素膜上；

S3：硝酸纤维膜上标记好每种病毒探针的位置，每种病毒探针点3次，每点点样8μL，晾干，重复点三次；

S4：于365nm紫外光源下以90mJ/cm2的强度下照射使探针能固定在膜上；最后用0.05g/mL脱脂奶粉于37℃封闭1.5h，备用。

3.一种同时检测四种鱼类病毒的RPA扩增试纸检测方法，其特征在于：

S1：取检测试纸膜条，放入15mL离心管中5mL杂交缓冲液(0.015mol/L柠檬酸钠、0.15mol/L NaCl，Ph7.0)，加入5μL RPA扩增产物，于60℃反应10min。加入10mL洗液(0.015mol/L柠檬酸钠、0.15mol/L NaCl、0.1％SDS)清洗膜条。

S2：取出膜条后，使用PBS缓冲液(2.7mmol/L KCl、4.3mmol/L Na2HPO4、1.4mmol/LKH2PO4、0.3％Triton X-100，pH7.4)对HRP-标记链霉亲和素进行1:2000稀释，将膜条与5mL稀释HRP-标记链霉亲和素室温反应5min；

S3：最后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色底物避光显色5min，适时终止并观察结果；

S4：取10μL反应产物进行2％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到四种病毒扩增条带，且扩增条带符合预期大小，表示四种病毒RPA方法建立成功。

4.根据权利要求1-3所述的RPA引物和探针、RPA扩增试纸的制备及RPA扩增试纸检测方法在同时检测四种鱼类病毒中的应用。