[发明专利]一株重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用。所述重组毕赤酵母基因工程菌是由出发毕赤酵母的PAS_FragB_0067基因过表达后改造得到。本发明以能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115‑xyn为出发菌，首次过表达PAS_FragB_0067基因，成功构建重组菌0067*，提升了毕赤酵母生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，发酵效率低等的问题。并且改造后的毕赤酵母基因工程菌在连续发酵过程中发酵性能更高，产酶酶活性更强，在发酵上具有明显优势。

技术领域

本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株过表达PAS_FragB_0067基因的毕赤酵母菌及其构建方法与在产木聚糖酶中的应用。

背景技术

生物膜是微生物的一种普遍的存在方式，因为微生物在多细胞群体下的生存能力会大大提高，所以微生物会自发地倾向于形成生物膜或者菌落。生物膜能够形成在生物体或者非生物体的表面，呈膜样生长，对抗菌因子及外界各种压力有高度抗性。因此，生物膜在工业生产和医疗方面均被广泛关注。近年来对于真菌生物膜在人类医学中的作用研究越来越多，对真菌生物膜形成过程中基因的表达研究也日益增多，主要包括:与生物膜形成相关的主要基因、与对抗真菌药物抵抗相关的基因以及黏附及细胞壁合成基因等方面。

酵母菌絮凝作为细胞之间粘附的一种方式，有着非常重要的科学研究及工业应用价值。良好的絮凝特性既是酵母细胞应对环境胁迫产生的一种群体保护机制，同时为工业发酵过程提供了一种更加有效的、环境友好的、低廉的细胞分离及产品澄清途径。许多酵母在不利的环境条件下分化为多细胞表型。在酿酒酵母体系中，研究人员已经对FLO基因家族功能开展了丰富的研究。但是，细胞粘附过程和相关基因的调控机制是十分复杂的，FLO基因对酿酒酵母生物成膜能力及其对酿酒酵母发酵效果的影响，仍然未有普适性的调控理论。例如，Paola Di Gianvito等人在酿酒酵母F6789中敲除FLO1对絮凝能力无影响(Sci.Rep.,2017,7(1):1-12)；但Johan O.Westman等人的研究表明，逐渐删除FLO1中的串联重复会导致不同粘附表型的相应减少，例如粘附塑料和絮凝(Appl.Environ.Microb.,2014,80(22):6908-6918)。

毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一，具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，有可诱导的强启动子，具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、发酵纯化操作方法简便及易于工业化生产等特点，已成功地表达了许多极具价值的蛋白。目前，毕赤酵母菌体系中生物成膜吸附固定化发酵的研究报道较少，毕赤酵母FLO家族基因与生物成膜的相关调控机制也尚待探索。现有技术中，CN113046256A通过构建了一株过表达HSF1的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。CN112592844A构建了一株过表达凝集素LMAN2的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。然而毕赤酵母菌的生物成膜机制仍不明朗，这促使本领域技术人员继续探究细胞粘附相关基因与生物成膜的调控关系，从而更好的利用生物膜固定发酵，实现缩短发酵周期、循环使用细胞的目的。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种过表达PAS_FragB_0067基因的重组毕赤酵母基因工程菌，以期进一步研究毕赤酵母成膜机制和粘液素样蛋白基因PAS_FragB_0067(与FLO11结构域相关)在其中的调控作用。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的应用。