[发明专利]一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒，涉及微生物检测技术领域，所述的试剂盒中包括引物组合，所述的引物组合包括铜绿假单孢菌的上、下游引物，鲍曼不动杆菌的上、下游引物，肺炎链球菌的上、下游引物，金黄色葡萄球菌的上、下游引物和化脓性链球菌的上、下游引物。本发明检测呼吸道病原菌的方法针对临床疑似呼吸道感染样本，采用靶向扩增子测序技术结合多重PCR技术，相对其他靶向检测技术，引入单分子识别标签序列，可以实现对不同检测目标的半定量检测，准确性更高。本发明公开的方法经济、快速、特异性和准确性强，同时结果容易判读，在呼吸道病原体检测方面有较大的应用价值。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒。

背景技术

呼吸道感染（Respiratory Tract Infections）是指病原体从人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等部位侵入并进行繁殖导致的有传染性的疾病，是一种常见的感染性疾病。呼吸道感染的病原体可分为细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体和立克次体等类型。传统的分离培养及血清学检测方法费时繁琐，导致检测不及时，灵敏度不高，阳性率较低等不足。

宏基因组二代测序（mNGS）可应用于呼吸系统疾病病原体检测，mNGS拥有更高的敏感性，更快的检验速度，但在实际应用中，还有一些难以解决的问题：包括其对于胞内菌、真菌等核酸提取效率低的微生物检测敏感性较低、对低浓度的胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌的检测敏感性偏低、高宿主背景、测序结果标准难以统一、高成本等，限制了其广泛应用。

中国专利CN202110024096.5中公开了一种引物组合物、测序试剂盒及检测方法，该组合物包括第一组引物组合物、第二组引物组合物和16S引物对，所述的第一组引物组合物包括多个用于检测引起呼吸道感染的病毒病原体的引物对，第二组引物组合物包括多个用于检测引起呼吸道感染的细菌病原体的引物对，所述的16S引物对用于与所述的第一引物组合物或第二引物组合物同时检测引起呼吸道感染的病原体。该发明所提供的引物组合物，可以同时检测30余种呼吸道病原体，部分病原体可根据测序序列进行亚型区分。

中国专利CN202111356118.4中公开了一种检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途，所述的组合物包括甲型流感病毒的上、下游引物和探针、乙型流感病毒的上、下游引物和探针、鼻病毒的上、下游引物和探针、呼吸道腺病毒的上、下游引物和探针，该发明所述的组合物结合荧光探针法，能够使用两个管在一次试验中同时进行，其成本低、通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息，并且操作简单，结果的读取过程可通过CT值进行判定，并且避免了样本间交叉感染引起的假阳性和环境污染。

中国专利CN202011098442.6中公开了一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针组合，所述的引物探针组合包括检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的上下游引物和探针，该试剂盒的检测准确性好、特异性强、灵敏度高，重复性好、假阴性和假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒或细菌引起的呼吸道感染，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。

本发明提供的基于靶向测序的呼吸道病原菌检测方法，无需进行人源基因组DNA的去除，即可达到对靶标病原微生物的富集。本发明的检测试剂盒可实现金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌、化脓性链球菌的同时检测，本发明的检测试剂盒搭配快速测序的技术，可以快速获得检测结果，实现快速即时检测，应用于呼吸道感染性疾病的诊断。

发明内容

本发明的术语和声明：

本发明中，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序。

本发明中，术语“引物”是指人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。