[发明专利]一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测呼吸道病原菌的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包括铜绿假单孢菌的上游引物、铜绿假单孢菌的下游引物、鲍曼不动杆菌的上游引物、鲍曼不动杆菌的下游引物、肺炎链球菌的上游引物、肺炎链球菌的下游引物、金黄色葡萄球菌的上游引物、金黄色葡萄球菌的下游引物、化脓性链球菌的上游引物和化脓性链球菌的下游引物；

所述的铜绿假单孢菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的铜绿假单孢菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的鲍曼不动杆菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的鲍曼不动杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的肺炎链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述的肺炎链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的金黄色葡萄球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述的金黄色葡萄球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述的化脓性链球菌的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述的化脓性链球菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.根据权利要求1所述的引物组合在制备用于检测呼吸道病原菌的试剂盒中的应用。

3.一种检测呼吸道病原菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的呼吸道病原菌包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿色假单胞菌和化脓性链球菌。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括正向引物F1和反向引物R1；

所述的正向引物F1包括连接序列Read 1和单分子识别标签序列SMB；

所述的连接序列Read 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

所述的单分子识别标签SMB的序列为NNNNNNNN，其中N代表A、T、C、G任一种。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的反向引物R1包括连接序列Read2；所述的连接序列Read 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括第二轮PCR扩增引物，所述的第二轮PCR扩增引物包括正向引物F2和反向引物R2；所述的正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述的反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的第一轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环20次；72℃后延伸1 min，循环1次。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的第二轮PCR扩增反应程序为：98℃预变性2 min，循环1次；98℃变性10 sec，58℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，循环6次；72℃后延伸1 min，循环1次。

10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，使用试剂盒的测序结果鉴定待测样本中的呼吸道病原菌的分析步骤如下：

（1）去除低质量及过短序列；

（2）剩余序列与病原微生物靶标序列进行比对；

（3）统计准确比对上相应靶标的读取数；

（4）分析相同读取数对应的SMB序列，若SMB序列相同，可认为来源于同一母链模板；

（5）统计不同读取数分别对应不同SMB数量；

（6）识别病原微生物靶标序列cut off值应为准确比对读取数大于3且SMB大于1。