[发明专利]检测多主棒孢B-I280V突变的引物组合

说明书

本发明公开了检测多主棒孢B‑I280V突变的引物组合。本发明公开的引物组合由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成，各引物的序列分别如序列表的SEQ ID No.1‑SEQ ID No.6所示。实验证明，本发明的引物组合具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简易的特点，可特异、快速、高效地检测到黄瓜棒孢叶斑病发病组织中多主棒孢B‑I280V突变体，不需要复杂的仪器，并实现可视化，为有效发现田间多主棒孢B‑I280V抗性突变类型，制定有效抗药性治理方案提供技术支持。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测多主棒孢B-I280V突变的引物组合。

背景技术

多主棒孢(Corynesporacassiicola)是一种全球性真菌，在世界各地均有报道。其寄主范围广泛，可为害葫芦科、茄科、豆科等蔬菜。由多主棒孢引起的黄瓜棒孢叶斑病已成为一种世界性病害，一般田间发病率为10％～25％，严重时可达60％～70％，甚至100％，造成严重的经济损失。由于多主棒孢具高度变异性，易产生抗药性，导致该病害很难防治。靶基因的点突变是多主棒孢对杀菌剂产生抗药性的重要机制之一，目前已报道B-I280V、B-H278Y/R/L、C-S73P、C-N75S、D-S89P、D-D95E、D-H105R和D-G109V等突变可导致多主棒孢对SDHIs杀菌剂产生不同水平的抗性，其中B-I280V突变体低抗啶酰菌胺和吡噻菌胺，中抗氟吡菌酰胺和萎锈灵。此外，该突变体与田间野生型敏感菌株相比无适合度代价，并在华北地区逐渐发展为田间优势群体。因此，及时、快速检测该基因型在田间的发生，对该病害的科学防治尤为重要。

传统的病原菌抗性检测方法包括菌丝生长速率法、孢子萌发法、抑菌圈法等，但存在工作量大、工作周期长等缺点。随着分子生物技术的发展，多种分子检测手段应用于病原菌抗药性检测，如普通PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)、多重等位基因PCR(multiplex allele specific PCR,MAS-PCR)等，但需要特定的PCR扩增仪、凝胶电泳仪和凝胶成像仪等，过程繁琐，且检测时间长，不能满足快速检测的要求。

2000年日本荣研化学株式会社研发了一种环介导等温扩增(LAMP)的新方法，该方法使用了一种链置换DNA聚合酶和针对靶基因6个区域设计4个特异性引物，在等温条件下即可高特异性、高效率快速扩增DNA，若添加环引物，扩增时间可缩短至原来的1/2～1/3。LAMP反应的结果观察有多种方式，可以通过浊度仪实时监测、凝胶电泳形成梯形条带，也可以通过添加不同类型的指示剂实现可视化。然而，目前针对多主棒孢B-I280V突变的LAMP检测体系还未建立。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测多主棒孢B-I280V突变。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测多主棒孢B-I280V突变的引物组，所述引物组由引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、引物LPF和引物LPB组成；

所述引物FIP为序列表的SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

所述引物BIP为序列表的SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物F3为序列表的SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

所述引物B3为序列表的SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；

所述引物LPF为序列表的SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；

所述引物LPB为序列表的SEQ ID No.6所示的单链DNA分子。

上述引物组中，各单链DNA可独立包装，也可包装在一起。所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物F3、所述引物B3、所述引物LPF和所述引物LPB的摩尔比为8:8:1:1:4:4。