[发明专利]诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种诊断布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物及SEQ ID No.7～SE Q ID No.9所示的TaqMan探针。本发明的方法能特异性区分疫苗免疫病原核酸和自然感染病原核酸，同时具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点，适合对背景清楚的临床样本(鼻/肛拭子、牛奶、可能污染的饲料或饲草等)直接检测，重点用于免疫净化场临床样品的监测，为布鲁氏菌病准确诊断和及时防控提供技术支持。

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染的三重TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于兽医微生物学诊断领域。

背景技术

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要人畜共患病，被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定必须通报的疫病，我国属于优先防制的重大动物疫病。家畜感染布病后生殖系统受到严重侵害，雌性动物表现大量流产、不孕和死胎等，雄性动物出现睾丸炎。人则表现为间隙发热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大等症状。近年来，人畜布病发病率高位流行，给养殖业和公共卫生安全造成严重损失。在布病严重流行的情况下，对牛羊等易感家畜进行大规模免疫是控制布病的最有效手段。牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌S2株疫苗是我国应用最为广泛的疫苗，两者批签发总量约占全国98％。

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌，根据表型分为光滑型(S)和粗糙型(R)。该菌宿主较为广泛，能感染猪、牛、犬和沙林鼠等动物，可分为6个经典种19个生物亚型，分别为羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)、绵羊附睾种(B.ovis)、沙漠森林野鼠种(B.neotomae)和犬种(B.canis)。不同种布鲁氏菌的基因组同源性在90％以上。其基因组约3.3Mb，编码3200～3400个基因，均由2条独立且完整的环状DNA染色体组成，大小分别为2.1Mb和1.2Mb。

血清学方法是当前诊断动物布病的主要方法，其主要基于检测抗布鲁氏菌脂多糖(LPS)抗体。我国最常用的动物布病疫苗株(S2、A19)与野毒感染株都属于光滑型菌株，均诱导机体产生抗脂多糖抗体，因而无法通过现有血清学方法区分疫苗免疫和自然感染。此外，布鲁氏菌以胞内寄生为主，检测抗体局限大。因此从病原学上实现免疫与自然感染菌株检测是较为可行的策略。

对临床样本病原性核酸检测也是快速诊断疫病的有效方法。通过比较基因组学，能获得布鲁氏菌强弱毒菌差异信息，再运用布鲁氏菌全物种比较，获得鉴别诊断标识，为从病原学上区分疫苗免疫与自然感染提供可能。如杨博涵(2020)从布鲁氏菌A19疫苗株和野毒株2308的差异部分，共计碱基缺失28处，增添30处，其中共有24个序列碱基增添20bp以内，共有22个序列碱基缺失在20bp以内，建立的方法可有效区分A19疫苗株、其他疫苗株和野毒株。刘炳滟(2020)运用上述同样方法，成功发现用于鉴别布鲁氏菌S2疫苗株核酸标识序列。而BCSP31、IS711是报道的布鲁氏菌属检测通用基因，已广泛用于属的鉴定。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。该技术使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。此外，具有灵敏度高、速度快、高通量、可直接定量等优点，该方法已较为成熟，并广泛用于疫病诊断，如新冠病毒、非洲猪瘟病毒检测等。