[发明专利]一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法

说明书

本发明提供了一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法。该策略针对目标exRNA，设计了可与之高特异性结合的锁环探针，同时依赖连接反应增强识别，可实现目标序列的精准靶向；利用滚环扩增反应对低丰度exRNA进行扩增，实现信号的一次放大；进一步将DNAzyme与RCA产物耦合，利用Mgsupgt;2+/supgt;依赖的DNAzyme自催化切割自身核糖核酸底物的特点释放荧光信号并实现信号的二次放大。本发明简便可控，具有特异性强、灵敏度高及反应恒温等优点，可检测低至1pM的靶标exRNA，且具有出色的特异性，能有效区分靶标与其它miRNA序列，为低丰度exRNA的精准检测及探索未知外泌体RNA功能提供了新的研究思路。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体为一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法。

背景技术

外泌体几乎存在于所有的体液中，是RNA、DNA、蛋白质和脂质转移的重要载体，具有独特的生物学特性。通过细胞间通讯，外泌体可与邻近细胞交流，从而调节细胞微环境、参与细胞分化和促进肿瘤细胞的增殖侵袭等。越来越多的证据表明，外泌体RNA中包含原始细胞和疾病进展有关的重要信息，异常的外泌体RNA表达与疾病的发生发展密切相关。长期以来，外泌体RNA被认为是有价值的疾病诊断和预后生物标志物，在各种病理过程中发挥着重要的调节作用，可用于肿瘤早期诊断、疾病监测和治疗反应评估等。因此，实现低表达和微小变化的exRNA的精准检测不仅有助于理解外泌体的生物学作用，而且能够为医学诊断提供新视角。

RNA印迹法是最早用于RNA检测的方法之一，但其只能进行半定量检测，灵敏度不高，且受限于使用的抗体和探针的选择。RNA测序技术检测通量高，但数据分析复杂，且价格昂贵，不适用于大规模的检测。近年来，微流控技术由于其高度集成、速度快和可精准控制微尺度流体等优势在外泌体分离和检测领域得到广泛关注，但用于外泌体RNA检测时存在灵敏度差或检测偏差大等问题。常规PCR技术需要精确的温度控制且在扩增过程中可能产生假阳性信号，因此限制了该方法的广泛应用。后来开发的核酸等温扩增技术可在恒温条件下实现核酸的扩增检测，提高了反应稳定性，但针对低丰度exRNA的灵敏检测方面，总体存在设计方案复杂、需对探针进行荧光标记等不足之处。

基于上述原因，开发一种能够精准检测外泌体RNA的低成本、高灵敏分析方法对于后续研究具有重要意义。滚环扩增反应是一种常用的核酸等温扩增技术，具有特异位点靶向性及优异的灵敏度，可在恒温条件及热稳定DNA聚合酶存在的情况下进行反应。DNAzyme是一种单链催化核酸，具有类似蛋白酶(如辣根过氧化物酶HRP)或内切核酸酶的功能，可在恒温无酶的条件下自催化切割自身核糖核酸底物。此外，Mg²⁺依赖的DNAzyme具有合成简单、特异性强及序列设计灵活等优点，在RNA检测领域展现出不凡的应用前景。考虑到外泌体复杂性及外泌体RNA的检测难度，本发明将滚环扩增反应与DNAzyme结合，利用滚环扩增反应较高的扩增效率及DNAzyme自催化循环切割底物的特点，构建了一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme的双重等温放大技术，期望实现低丰度exRNA的精准检测和为疾病早期诊断提供新的技术支持。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法，用于实现低丰度exRNA的精准检测。本方法针对靶标exRNA，设计了可与之特异性结合的锁环探针，并耦合T4 DNA连接酶增强识别机制，将靶标与锁环探针连接成完整双链结构；进而在Phi29 DNA聚合酶及引物作用下触发滚环扩增反应，利用滚环扩增反应信号放大的优势对低丰度exRNA进行扩增，实现信号的一次放大；随后将DNAzyme与滚环扩增产物耦合，利用Mg²⁺依赖的DNAzyme自催化循环切割底物释放荧光信号，同时将信号进行二次放大，最后可通过酶标仪荧光检测系统对靶标exRNA进行检测分析。该技术具有特异性强、灵敏度高及反应恒温等优点，能够定量检测外泌体中低丰度的RNA，在疾病的精确诊断和辅助临床监测等方面具有广阔的应用前景。