[发明专利]一种使用实时荧光定量PCR技术快速检测药品中白色念珠菌的方法

说明书

本发明涉及一种使用实时荧光定量PCR手段快速检测药品中控制菌白色念珠菌的方法。本发明根据白色念珠菌ITS2基因序列，设计特异性引物和探针，可以特异性的检测出药品中的白色念珠菌，达到快速检测药品中白色念珠菌的目的。本发明灵敏度高，特异性强，耗时短，能够在第一时间得到药品的检测结果，并提出有效的改进措施。本发明从真菌的培养到真菌基因组的提取和PCR反应结束出结果，全程只需要3‑5 d，比中国药典的方法节省了2‑5 d；灵敏度高，基因组灵敏度可以达到10^‑2 ng；白色念珠菌含量的灵敏度可达到2 cfu·g(ml)^‑1且灵敏度与药典方法完全一致。本研究可以作为《中国药典》控制菌检查法的补充方法。可以通过该方法对药品中的白色念珠菌进行快速检测，保护消费者的用药安全和合法权益，为加强药品的监管力度提供技术支持。

技术领域

本发明涉及微生物检验检测技术领域，具体涉及一种使用实时荧光定量PCR技术快速检测药品中白色念珠菌的方法。

背景技术

白色念珠菌( Candida albicans)是一种内源性真菌，属于子囊菌亚门中的酵母纲、酵母目、酵母科、酵母菌属、假丝酵母菌种，故又称白色假丝酵母菌。白色念珠菌是一种条件致病菌，是医学全身性真菌感染病的重要原因之一，通常存在于健康人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，则本菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病。常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。药品微生物控制是药品质量保证的重要组成部分，药品污染微生物不仅直接影响药品的有效性，更有可能危及用药患者的生命安全；微生物污染还是评价药品质量和安全性的重要指标。《中国药典》2020年版四部通则“1107 非无菌产品微生物限度标准”中规定，阴道、尿道给药制剂不得检出白色念珠菌（1 g、1 ml或10 cm²）。中国药典规定的白色念珠菌检查方法，需要进行增菌培养，选择和分离培养，全部过程需要5-10 d；此方法主要采用传统的生化反应和形态检查，虽然操作简单，但是步骤较多，时间长，对实验人员的经验要求较高，无法快速的得到检测结果，效率较低。

实时荧光定量PCR (real time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR) 是近些年兴起的分子生物学技术，目前该技术已在医学检验、疾病分析、食品微生物检测及源性成分检测等研究等领域广泛应用，但是在药品白色念珠菌检查中的应用却未见报道。本发明利用实时荧光定量PCR技术建立药品中白色念珠菌的实时荧光定量PCR快速检测方法，为药品中控制菌的快速检测提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种使用实时荧光定量PCR技术快速检测药品中白色念珠菌的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种药品中白色念珠菌成分检测用引物和探针

上游引物F：5’-CGCTGGGTTTGGTGTTGAG-3’；

下游引物R：5’-GTTACCGCCGCAAGCAATG-3’；

探针序列P：

 5’-（FAM）CGGTAGTGGTAAGGCGGGAT-3’(MGB）。

（1）供试液的制备和增菌培养：

按照“中国药典2020年版四部 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”中白色念珠菌的检查方法制备供试品、供试品阳性、阳性对照、阴性对照，上述溶液分别置于23 ℃恒温培养箱中过夜培养5 d。

（2）细菌基因组的提取