[发明专利]一种生物纳米传感器

说明书

本发明提供一种生物纳米传感器，用于检测卵巢癌外泌体miRNA‑21，包括核酸探针HT、HC和HG；探针HT含有靶标分子杂交区；探针HC含有富C序列，用于合成无荧光的DNA模板银纳米簇；探针HG含有富G序列，用于激活DNA模板银纳米簇的荧光；且探针HG含有分别与HT和HC互补配对的碱基序列。该传感器无需标记荧光染料、成本低；其DNA模板银纳米簇可穿过外泌体膜直接进入外泌体内实现原位荧光激活，无需裂解外泌体、无需提取miRNA‑21、操作简便；本发明实现了低背景、高灵敏度和高选择性检测外泌体miRNA；且其抗血清干扰能力强。该技术为卵巢癌外泌体miRNA的液体活检提供新思路，具有临床应用价值。

技术领域

本发明属于分析检测领域，更具体地，涉及一种用于特异性检测外泌体miRNA-21的生物纳米传感器。

背景技术

外泌体microRNA(miRNA)是一类长度为18-25个核苷酸的小分子非编码小RNA，在细胞间的物质交换和信息交流中发挥重要作用。目前一些特定的外泌体miRNA被用作各种癌症的诊断生物标志物，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和卵巢癌。目前常用的检测外泌体miRNA的方法是RT-PCR、电化学法、Northern blot、高通量测序等，各种方法均有优缺点，但是普遍存在操作繁琐、对样品要求高等缺点。因此，急需发展操作简单且原位检测血浆标本外泌体中miRNA的液体活检方法。

卵巢癌是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90％～95％为卵巢原发性的癌，另外5％～10％为其它部位原发的癌转移到卵巢。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60％～70％已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。

因此，本领域需要一种用于检测卵巢癌外泌体microRNA-21的生物纳米传感器，用于及时诊断卵巢癌。

发明内容

核酸探针是利用核酸分子杂交的特性对特定核酸序列进行检测的工具，由于具有高灵敏度、高特异性、设计简单等优点而被广泛应用于各种疾病分子标志物的分析检测。而DNA稳定的银纳米簇(DNA-AgNCs)是以DNA为模板合成的一种新兴荧光纳米材料，具有尺寸小、合成简单、生物相容性好以及量子产率高等优点，目前已被广泛用于生物大分子和肿瘤细胞检测等领域。研究证实DNA-AgNCs合成后在接近富含鸟嘌呤的DNA序列时荧光会显著增强。我们前期研究报道了DNA-AgNCs可穿过脂质膜进入细胞核内。因此，结合核酸探针的杂交特性和DNA-AgNCs的膜穿过性以及激活式荧光信号模式，本申请的发明人根据miRNA靶标序列设计了一种可进入卵巢癌外泌体内的激活式生物纳米传感器，实现对卵巢癌外泌体miRNA-21的原位检测。此过程不仅恒温、简单、不需酶辅助，而且能有效地缩短检测时间和提高灵敏度，为外泌体miRNA的液体活检提供了新思路。同时，以DNA-AgNCs作为免标记型的信号输出元件进一步降低了检测成本。

本发明的目的在于设计一种基于发夹型核酸探针和DNA-AgNCs的检测卵巢癌外泌体miRNA-21的生物传感器，结合了核酸探针的杂交特性和DNA-AgNCs的荧光特性，优点在于检测成本低、操作简单、不需裂解外泌体、不需要提取RNA，同时可对外泌体miRNA-21进行原位检测，提供了一种针对靶标卵巢癌外泌体miRNA-21的原位检测方法和试剂盒。

因此，本发明提供一种生物纳米传感器，用于检测卵巢癌外泌体microRNA-21，其特征在于，所述生物纳米传感器包括核酸探针HT、HC和HG；探针HT含有靶标分子杂交区；探针HC含有富C序列，用于合成无荧光的DNA模板银纳米簇；探针HG含有富G序列，用于激活DNA模板银纳米簇的荧光；且探针HG含有分别与HT和HC互补配对的碱基序列。

在一种具体的实施方式中，所述HT、HC和HG的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示；