本发明涉及一种适宜分泌表达病原微生物抗原的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体质粒以及其在制备病原微生物疫苗中的应用。本发明所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体质粒,是以大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体质粒pBCG-2000为基础构建的;插入经改造的序列为SEQ ID NO.1的结核分枝杆菌热休克蛋白60启动子调控序列;插入人工合成的序列为SEQ ID NO.2的T4转录终止序列;插入经改造的序列为SEQ ID NO.3的卡介苗抗原基因85b的信号肽序列;添加序列为SEQ ID NO.4的人工合成序列。本发明所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体质粒,可应用于抗弓形虫、抗SARS冠状病毒以及抗结核杆菌的重组疫苗研究。