[发明专利]一种低质量FFPE DNA的处理方法

说明书

本发明公开了一种低质量FFPE DNA的处理方法，包括如下步骤：(1)将提取自FFPE样本的DNA与热修复试剂混合，进行热修复，该热修复试剂包括用于提取核酸的裂解液和蛋白酶K；(2)将步骤(1)所得物料进行纯化，以去除其中未反应的热修复试剂，获得热修复DNA；(3)将上述热修复DNA与酶修复试剂混合，进行酶修复，该酶修复试剂具有脱氨基修复、缺刻修复、氧化碱基修复和3’端封闭修复的功能；(4)将步骤(3)所得物料进行纯化，以去除其中未反应的酶修复试剂，即得。本发明处理低质量FFPE DNA后，可提高NGS样本的参数值，包括覆盖度、平均有效深度、均一性的参数，进而提高样本检测的成功率和准确性。

技术领域

本发明属于FFPE DNA样本处理技术领域，具体涉及一种低质量FFPE DNA的处理方法。

背景技术

FFPE样本(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded，即福尔马林固定石蜡包埋样本)，是临床病理检验、肿瘤基因检测、药物靶点基因诊断中最广泛处理方法的样本类型。FFPE样本中的脱氧核糖核酸(DNA)经过了中性福尔马林固定、高温浸蜡等步骤后容易发生蛋白和DNA、DNA与DNA的交联损伤，并且长期保存后容易发生DNA双链断裂、碱基损伤(包括脱碱基、切刻、胞嘧啶脱氨基、鸟嘌呤氧化等)等，这类样本统称为低质量FFPE样本，其抽提的核酸(FFPE DNA)称为低质量FFPE DNA。研究表明，低质量FFPE样本DNA可能由于组织类型、固定时间、FFPE蜡块保存年限导致发生DNA交联、断裂或碱基损伤，使得DNA可扩增性差，造成DNA无法用于后续处理方法，例如PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)或NGS(Next Generation Sequencing，二代测序)的处理方法。在著名的Profound临床研究中，前列腺癌FFPE样本的NGS检测成功率仅有69％。

FFPE样本的制备过程分为甲醛固定、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋等5个步骤，大致过程是将组织内的物质相互交联固定，并去掉组织中的水分，使用石蜡包埋以方便切片。在FFPE样本的制备步骤的第一步是固定，这一步会使自由的分子链被交联在一起，从而起到固定组织的作用，但这一步也会对DNA等分子产生不利影响，比如使核酸容易出现片段化、蛋白与核酸交联等。最终导致很难获得高质量的DNA或者RNA分子，这也是制约FFPE样本在临床基因检测处理方法中的最大难题。在临床基因检测处理方法中，样本需要先进行核酸提取后才进入检测，FFPE样本的核酸抽提经过脱蜡、裂解液和蛋白酶K消化、热修复、纯化等步骤，样本提取完核酸后基本确定了样本的质量并且直接用于后续检测。对检测前的抽提好的核酸进行处理是否可提高检测成功率较少有研究。

近年来，随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，针对FFPE样本无法获得较高质量基因组DNA及RNA等方面的难题也逐渐得到解决。比如出现了专门针对FFPE样本提取基因组DNA、RNA的试剂盒，在提取过程中通过核酸分子的修复，把对核酸样本的破坏程度降到最低。虽然这些技术的进步都或多或少提高了FFPE样本在临床基因检测的处理方法，但是这些技术目前较多集中在FFPE样本提取基因组DNA过程中，较少关注到提取完的DNA的处理。目前在二代测序基因检测领域，商业化的构建文库(简称建库)试剂或文库构建方法对于低质量FFPE样本没有较好的解决方案。因此，如何解决DNA的交联、断裂或碱基损伤，提高DNA的可扩增性，是本领域急需解决的重点和难点。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种低质量FFPE DNA的处理方法。

本发明的技术方案如下：

一种低质量FFPE DNA的处理方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将提取自FFPE样本的DNA与热修复试剂混合，进行热修复，该热修复试剂包括用于提取核酸的裂解液和蛋白酶K；

(2)将步骤(1)所得物料进行纯化，以去除其中未反应的热修复试剂，获得热修复DNA；