[发明专利]用于检测白蜡枯梢病菌的LAMP引物组及其应用和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测白蜡枯梢病菌的LAMP引物组及其应用和检测方法，属于基因工程技术领域。本发明以白蜡枯梢病菌的特有基因簇CAG8952169.1作为靶标基因设计并筛选出可用于LAMP检测白蜡枯梢病菌的特异性强，且灵敏度高的引物组。本发明提供的LAMP引物组具有通用性强、特异性强、灵敏度高和准确性好的优势，可不经培养直接从子实体中提取DNA，进行快速分子检测，能实现从寄主植物材料中快速检测，尤其适用于野外林场和海关检疫口岸对梣属苗木材料的快速检测。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测白蜡枯梢病菌的LAMP引物组及其应用和检测方法。

背景技术

白蜡枯梢病菌(Hymenoscyphus fraxineus)主要侵染木犀科(Oleaceae)白蜡属(Fraxinus)植物。白蜡枯梢病菌的人为传播，主要通过疫区国家/地区的寄主苗木材料的运输；自然传播是通过病原菌能产生子囊孢子，子囊孢子在空气中扩散作近距离传播。白蜡枯稍病菌的有性型阶段为微小蘑菇状的子实体，在枯落植物组织表面聚生，无性阶段侵染白蜡树植物，形成菱形的黑色病变或溃烂，患有白蜡枯稍病的植株早期症状是叶柄和叶脉出现棕色至黑色的坏死病变，随后坏死病变包围整个叶柄导致顶端叶片枯萎和过早脱落，呈现顶端枯梢病状，严重时造成整个树冠坏死。该病可造成白蜡树大面积死亡，引起重大经济和生态损失。

白蜡枯稍病菌生长的最适温度为20℃，但在很宽的温度范围内都能生长，既能适应寒冷的温度，在冬季霜冻天气下生存，也能在35℃左右的高温下生存，适应性强。因此在病害早期阶段发现病害，对于预防病害暴发和选择准确的控制策略至关重要，实现病原的有效、快速和准确检测，可以从根源上控制病害的扩散蔓延，也是白蜡枯梢病防治的首要工作。目前采用病原菌培养，后经形态学鉴定方法进行白蜡枯稍病的检测，形态学鉴定方法易造成误判或漏判，难度较大；而普通PCR或巢氏PCR技术步骤繁琐，从取样到获得结果需要6-8h，费时费力，灵敏度低，且需要在实验室内进行。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是基于PCR技术的替代方法，利用4至6个寡核苷酸引物和链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)，在恒定温度下进行扩增，2017年Catherine等人基于ITS序列设计了H.fraxineus的特异性引物，使用OptiGene LAMP试剂盒开展白蜡枯梢病菌的LAMP检测，其灵敏度检测极限为7pg/ul，其灵敏度不高。因此提供一种特异性引物组应用于白蜡枯稍病菌的LAMP检测，使其具有通用性强、特异性强、灵敏度高和准确性好的优势，对白蜡枯梢病的早期预警，具有重要的实践价值和意义。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于检测白蜡枯梢病菌的LAMP引物组及其应用和检测方法，本发明提供的LAMP引物组具有通用性强、特异强、灵敏度高和准确性好的优势，比以往LAMP检测的灵敏度提升了近1000倍；本发明可不经培养，直接从子实体中提取DNA，进行快速分子检测，可实现从寄主植物材料中快速检测的目的。

本发明采用以下技术方案：

一种用于检测白蜡枯稍病菌的LAMP引物组，包括下列引物：

正向外引物F3：5’-CCACCATCAAGTGAACGT-3’(SEQ ID NO：2)；

反向外引物B3：5’-GGATCCTGCTCAAAGCATGT-3’(SEQ ID NO：3)；

正向内引物FIP：

5’-CCGGTCGTCCATACCACTGTTTTTGGCGAGATGAGGCTGAA-3’(SEQ ID NO：4)；

反向内引物BIP：

5’-AAGGAGGTGTTACAGGTGTGGCACAAAAGATGGCTTACCGCA-3’(SEQ ID NO：5)。