[发明专利]检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的引物和探针及方法

说明书

本发明公开了检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的引物和探针及方法，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；本发明采用“突变阻滞扩增(ARMS)、分子信标探针(Molecular Beacon)和锁核酸(LNA)”联合使用检测HP克拉霉素耐药突变相关的技术，通过三种方法合理设计，进行梯度实时荧光PCR扩增，达到检测目的。该方法检测HP克拉霉素耐药突变敏感度高，特异性强，并且在实际样本检测中显示出了较好的检测效果。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于幽门螺杆菌克拉霉素耐药突变检测的方法，本发明还涉及到利用所述的引物探针相组合检测HP克拉霉素耐药的试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)在全球感染率超过50％，我国平均感染率达到了59％。HP是胃部疾病的罪魁祸首，常引起慢性胃炎、胃溃疡等，甚至引起胃粘膜组织相关淋巴瘤(MALT)甚至胃癌。2015年《幽门螺杆菌胃炎京都全球共识》指出HP是一种感染性疾病，应该积极的治疗。我国《第六次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》指出，HP感染者有意愿治疗者，应治尽治。目前，我国HP治疗方案推荐四联疗法，包括铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素。克拉霉素在我国HP根除治疗中有十分重要的作用，最早的《共识》中将包含克拉霉素的方案列为一线治疗方案。在目前治疗HP的方案中，克拉霉素常被作为经验性用药的首选。然而，由于耐药率的不断升高，我国HP初次根治成功率正在急速下降。我国《共识》指出，HP克拉霉素的耐药率达到了20％～50％，这正是导致根治成功率下降的主要原因。《共识》也明确指出，检测耐药具有十分重要的临床价值。检测HP克拉霉素耐药分为传统方法和分子检测方法。传统方法，由于HP分离培养困难，耗时长，成功率低，技术要求高，阻止了其在临床实际中的使用。

HP克拉霉素耐药，主要是由于其23S rDNA耐药相关突变引起，主要有A2412G、A2142C、A2143G几种突变。目前，检测克拉霉素耐药突变的方法有Taqman探针法、高分辨溶解曲线方法等，这些方法的单一使用，区分力比较低，在实际检测中效果不理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23S rDNA突变的引物和探针组合及检测方法。

本发明的技术方案为：用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23S rDNA突变的引物和探针组合，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；所述突变阻滞扩增引物组由引物野生ARMS-F、引物A2142G-ARMS-F、引物A2142C-ARMS-F、引物A2143G-ARMS-F和引物ARMS-R组成，分子信标引物和探针组合由引物MBeacon-F、引物MBeacon-R和探针野生-MBeacon-P、探针A2142G-MBeacon-P、探针A2142C-MBeacon-P、探针A2143G-MBeacon-P组成；所述引物野生ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物A2142G-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，引物A2142C-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物A2143G-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，引物ARMS-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示，引物MBeacon-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物MBeacon-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，探针野生-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，探针A2142G-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，探针A2142C-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQID No.10所示，探针A2143G-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；其中，探针野生-MBeacon-P从5’端起第15个碱基A和第16个碱基A为锁核酸，探针A2142G-MBeacon-P从5’端起第15个碱基G为锁核酸，探针A2142C-MBeacon-P从5’端起第15个碱基C为锁核酸，探针A2143G-MBeacon-P从5’端起第16个碱基G为锁核酸。