[发明专利]检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的引物和探针及方法

权利要求书

1.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23S rDNA突变的引物和探针组合，其特征在于，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；所述突变阻滞扩增引物组由引物野生ARMS-F、引物A2142G-ARMS-F、引物A2142C-ARMS-F、引物A2143G-ARMS-F和引物ARMS-R组成，分子信标引物和探针组合由引物MBeacon-F、引物MBeacon-R和探针野生-MBeacon-P、探针A2142G-MBeacon-P、探针A2142C-MBeacon-P、探针A2143G-MBeacon-P组成；所述引物野生ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物A2142G-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，引物A2142C-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物A2143G-ARMS-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，引物ARMS-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物MBeacon-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物MBeacon-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，探针野生-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，探针A2142G-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，探针A2142C-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，探针A2143G-MBeacon-P的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；其中，探针野生-MBeacon-P从5’端起第15个碱基A和第16个碱基A为锁核酸，探针A2142G-MBeacon-P从5’端起第15个碱基G为锁核酸，探针A2142C-MBeacon-P从5’端起第15个碱基C为锁核酸，探针A2143G-MBeacon-P从5’端起第16个碱基G为锁核酸。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，探针野生-MBeacon-P 5′端标记发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，探针A2142G-MBeacon-P、探针A2142C-MBeacon-P、探针A2143G-MBeacon-P的5′端标记发光基团为HEX，淬灭基团为BHQ1。

3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有荧光PCR反应液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种，所述阴性对照为克拉霉素敏感HP菌株的DNA，所述阳性对照为克拉霉素耐药HP菌株的DNA。

5.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23S rDNA突变的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系为：

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7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，58℃退火30s(采集荧光)，40个循环。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，同时设立阳性对照和阴性对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信；FAM通道出现扩增信号为野生型，VIC通道出现扩增信号为耐药型，FAM/VIC通道同时出现信号为野生/突变杂合型。